Ce travail a été financé en partie par le financement de RAW de chacun des éléments suivants: subventions des NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, et R01 DK100237; Mars of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar octroi d&#39;une subvention # 5 FY12-75; les fonds de démarrage de l&#39;Université de Notre Dame College of Science et Département des sciences biologiques. Nous tenons tout particulièrement à remercier Elizabeth et Michael Gallagher, avec toute la famille Gallagher, qui donnait un don généreux à l&#39;Université de Notre Dame de favoriser recherche de cellule souche. Les bailleurs de fonds n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous remercions le personnel du Département des sciences biologiques pour leur soutien, et le Centre pour la recherche de poisson zèbre à Notre-Dame pour leur dévouement exceptionnel dans le soin et le bien-être de notre colonie de poisson zèbre. Enfin, nous remercions les membres de notre laboratoire de recherche pour leurs commentaires, discussions et idées à propos de ce travail,ainsi que Marigold (Maripooka) et Zinnia Wingert pour fournir hangar naturellement moustaches félines à faire plus d&#39;excellents outils de cils pour notre recherche.

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos.">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li><li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc/tfap2a+gene+function.">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Poisson zèbre se sont révélés être un organisme modèle très précieux pour toute la communauté de la recherche au cours des dernières années. Poisson zèbre présentent un degré élevé de conservation génétique avec celui des vertébrés supérieurs, et les avantages relatifs à leur anatomie, l&#39;élevage et cycle de vie font de cette espèce très prêtent à des analyses de laboratoire. Par ailleurs, la promotion des techniques moléculaires applicables au poisson zèbre a également encouragé l&#39;utilisation de cet organisme modèle dans la recherche scientifique. Par exemple, une grande variété de lignes de poisson zèbre transgénique a été générée pour étudier la progression de la maladie et à répondre à de nombreuses questions fondamentales qui sous-tendent les mécanismes clés du développement, y compris l&#39;organogenèse. En conséquence, sur la base de l&#39;utilisation dynamique de poisson zèbre à la fois la maladie et de la recherche développement, des méthodes de marquage des cellules et le signal de quantification sont un aspect crucial de l&#39;analyse des données. Bien que les méthodes qui emploient un fluorescenttibodies peuvent être utilisés pour détecter l&#39;expression de protéines dans le poisson-zèbre transgénique, les chercheurs s&#39;appuient généralement sur ​​les procédures standard comme WISH 12-16 à examiner la localisation spatio-temporelle de la transcription de gènes dans un échantillon de poisson zèbre transgénique non-fixe. En fait, WISH est l&#39;une des techniques les plus couramment utilisés en biologie 16, et est un outil essentiel utilisé pour caractériser le phénotype des mutations génétiques et des perturbations génétiques chimiques. Néanmoins, WISH est associé à un certain nombre de pièges et défis potentiels. Pour confirmer la spécificité de la ribroprobe antisens, ribosondes de détection peuvent être utilisés en tant que témoin pour évaluer la spécificité des motifs de coloration de ribosonde antisens. Alors que les articles 4 et 5 sont présentés dans l&#39;ordre de marquage et de détection d&#39;une sonde de digoxygenine marqué suivie par la sonde marquée à la fluorescéine, cet ordre peut être inversé. Typiquement, les signaux plus faibles (gènes dont les niveaux d&#39;expression plus faibles) sont mieux détectés avec des sondes marquées digoxygénine-et cette tachedéveloppée avec un premier substrat pourpre, suivie de la détection et de la coloration du signal plus fort (gène plus abondamment exprimée) en utilisant le substrat rouge. Cependant, si des réactions en deux couleurs vont être effectuées, il est recommandé que diverses combinaisons d&#39;étiquettes et de substrats sont testés pour trouver la procédure qui est le plus adapté pour la collecte et l&#39;analyse des données. En outre, les délais prévus pour le blocage, l&#39;incubation des anticorps et laver prévues aux articles 4-5 sont adaptés pour les embryons de moins de 24 heures après la fécondation; longs intervalles de ces mêmes étapes avec des embryons âgés peuvent conduire à l&#39;accumulation de sel sur l&#39;échantillon. Conseils étendus pour le dépannage embryon de poisson zèbre WISH norme ont déjà été documentées dans la littérature 12-16. Sans doute le problème le plus commun est une grande arrière-plan. Nous recommandons d&#39;augmenter le nombre de lavages MABT à l&#39;étape 4.7 à 15-20 lavages si nécessaire, même si, dans notre expérience la plus de la nuit MABT «super-lavage»donne d&#39;excellents résultats lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec 10 ou plusieurs lavages de MABT courts avant de procéder à l&#39;étape 4.8. Un autre exemple dilemme est mauvaise infiltration de la sonde, qui peut se produire avec de longues ribosondes. Cisaillement de la ribosonde suivant l&#39;étape 3.6 par hydrolyse alcaline peut contrecarrer cela. Dans notre expérience avec les jeunes des échantillons, la sonde cisaillement n&#39;est généralement pas nécessaire. Cependant, il faut garder à l&#39;esprit que les paramètres de ce genre peut être des facteurs contributifs dans le résultat d&#39;une expérience de WISH, et nous suggérer l&#39;examen de ces instructions de dépannage utiles déjà disponibles publiquement dans la communauté afin d&#39;affiner les paramètres expérimentaux pour la WISH dans votre propre recherche 12. En plus des techniques traditionnelles WISH 12-16, il ya eu une émergence continue de progrès dans les méthodes de WISH et protocoles alternatifs qui ont été formulées. Il s&#39;agit notamment de nouvelles façons de détection de signal, comme par l&#39;utilisation de fluorescencecence 17-19, les méthodes qui permettent la localisation des microARN 20. Même si, en dépit des nombreuses améliorations qui ont été apportées aux méthodes de marquage des cellules actuelles, l&#39;efficacité de ces procédures sont annulées si la tache (s) ne peut pas être facilement visualisés dans l&#39;échantillon d&#39;intérêt à un point de temps souhaité. Cette limitation est problématique pour les chercheurs en particulier quand il se rapporte à des stades embryonnaires de l&#39;ontogenèse du poisson zèbre, ce qui pourrait entraîner des lacunes dans notre compréhension des différents processus de développement qui se posent à ces moments. Au cours du développement de poisson zèbre normal, le sac jaune diminuera progressivement à mesure que les embryons de 11 ans. Par conséquent, à ces stades de développement ultérieurs (&gt; 24 heures après la fécondation), WISH coloration est assez simple à analyser car l&#39;embryon est plus grande par rapport à sa attenant jaune sac. Cependant, ce n&#39;est pas le cas de la scène queue de bourgeon de somitogenèse tôt (lorsque le embryonnairemasse est positionné autour du jaune) lorsque le sac vitellin opaque peut parfois occulter la visualisation de la tache. Par conséquent, la méthode de montage à plat a été conçu pour aider à alléger les problèmes d&#39;imagerie et d&#39;analyse de données associées à la caractérisation d&#39;échantillons d&#39;embryons de poisson zèbre précoces (schématisés à la Figure 1 et Figure 2), et a été largement utilisé depuis le phénotypage systématique des mutations génétiques isolés des premiers grands écrans génétiques 21. Depuis l&#39;avènement de la technique de montage à plat, l&#39;analyse des premiers stades de développement a été considérablement renforcée. Une fois que le jaune d&#39;oeuf est retiré de l&#39;embryon, il est possible de fixer la plate embryonnaire sur une lame de verre dans l&#39;orientation souhaitée pour l&#39;imagerie. Cette position bidimensionnelle permet la visualisation de l&#39;ensemble de l&#39;embryon à la fois, ce qui élimine la nécessité de faire tourner l&#39;échantillon. De nombreux tissus sont situées dans de larges domaines de l&#39;embryon, tels queles précurseurs qui forment le sang et les reins. En outre, on peut avoir besoin de comparer plusieurs différents tissus en développement à la fois. Montage à plat permet au chercheur de visualiser simultanément l&#39;ensemble du domaine de ces groupes de cellules, et peut donc grandement aider quantifications telles que des mesures d&#39;aire pour un tissus ou de cellules chiffres. Cette technique a finalement contribué à faire de nombreuses découvertes concernant une variété de mécanismes de développement importants qui sous-tendent l&#39;hématopoïèse, la neurogenèse et l&#39;organogenèse. Ainsi, une fois maîtrisé, les applications de cette technique simple pour les chercheurs sont très importantes. Par exemple, dans une étude sur le choix de la lignée au cours de l&#39;hématopoïèse, monter plat préparations d&#39;embryons de poisson zèbre à des étapes 14 et 18 somites (ss) ont été utilisés pour illustrer les changements survenus dans le profil d&#39;expression de la PU.1 zinc facteur doigt de transcription entre de type sauvage et GATA1 morpholino injecté embryons 22.Cette méthode a permis la détection d&#39;un domaine de PU.1 élargi à 18 ss, indiquant que GATA1 est probablement régulation de l&#39;expression de PU.1 dans la masse cellulaire intermédiaire (ICM) autour de ce point de temps. Embryons plat supplémentaires montés colorées pour différents gènes érythroïdes y compris gtpbp1 et Epsin démontré une perte de l&#39;expression de ces gènes mutants vlt qui étaient GATA1 - / -. D&#39;autres analyses ont montré aucun changement dans l&#39;expression de gènes tels que erythoid biklf testhymin et qui étaient connus pour être indépendante de l&#39;activité de gata. Par conséquent, conjointement avec leurs autres résultats expérimentaux, il a été révélé que GATA1 est essentiel dans la régulation de la différenciation des cellules au sein de la lignée de myélo-érythroïdes. Dans une étude du développement de la crête neurale, supports plats ont été utilisés pour examiner l&#39;expression de Crestin à Mont Blanc (mob) M610 mutants dans une étudel&#39;examen des rôles du Mont-Blanc et de la fonction du gène TFAP2A 23. À 10 et 20 ss, l&#39;expression de Crestin a été entièrement abrogé dans la tête et a diminué dans la région de tronc de mutants M610 mob par rapport à l&#39;expression normale de type sauvage, en fin de compte aider ce groupe à conclure sur l&#39;importance du Mont-Blanc et TFAP2A règlement pendant la formation de la crête neurale. En outre, en termes de l&#39;organogenèse, montures plates ont permis la découverte de la présence de domaines distincts dans le champ de progéniteur rénale précoce au cours du développement du rein embryonnaire du poisson zèbre, connu sous le nom pronephros. L&#39;embryon de poisson zèbre fournit un système conservé et encore anatomiquement simple pour étudier comment les progéniteurs rénaux donnent lieu à des unités fonctionnelles de néphrons qui composent les pronephros, un processus connu sous le nom néphrogenèse 6,7 (figure 4). Appartement monter analyse a été utile pour documenter les domaines de la reprogéniteurs internes et à disséquer le résultat de changements dans la signalisation de RA pendant pronephros structuration 6,7 (figure 5), qui était auparavant inconnu. Pris ensemble, ces exemples montrent qu&#39;il existe effectivement de nombreuses applications générales pour cet appartement protocole de montage dans l&#39;étude des divers processus qui se produisent au cours du développement normal et états pathologiques. Conceptuellement, cette procédure de montage plat est assez simple dans son ensemble. Cependant, les manipulations et le degré de finesse requis pour maîtriser cette méthode peut être assez difficile à maîtriser en l&#39;absence de démonstration visuelle. Par conséquent, ce protocole a été établi pour permettre aux chercheurs, en particulier ceux qui découvrent le modèle de poisson zèbre, la possibilité de mieux comprendre comment effectuer cette technique et partagez nos conseils sur les réactifs qui permettent d&#39;optimiser le traitement des tissus. Nous espérons que ce protocole permettra à terme d&#39;autres dans la communauté pour affiner les conditions d&#39;échantillonnage les plus idéal pour être used pour l&#39;imagerie haut de gamme, l&#39;analyse des données et la communication de leurs résultats dans les publications. En fin de compte, ce qui devrait permettre aux chercheurs de surmonter les obstacles anatomiques du poisson zèbre au cours de l&#39;embryogenèse précoce, qui peut obscurcir la présentation des résultats expérimentaux, et les résoudre grâce à l&#39;utilisation de cette technique simple mais importante.

Le poisson zèbre, Danio rerio, est devenu un organisme largement utilisé dans l&#39;étude de la biologie du développement. Poisson zèbre sont une tropicales, les espèces d&#39;eau douce de vertébrés appartenant à la famille des cyprinidés. Poisson zèbre ont été initialement utilisées pour la recherche environnementale pour obtenir des informations sur les dangers des polluants potentiels de l&#39;eau, car ils étaient faciles à obtenir, peu coûteux et facile à entretenir 1. Au cours des trente dernières années, le poisson zèbre a été reconnue comme un système de modèle vertébré génétiquement docile pour une foule de raisons. Poisson zèbre montrent un niveau élevé de conservation anatomique et physiologique avec les vertébrés supérieurs, y compris les mammifères 2,3. Récente annotation de la séquence du génome ont révélé qu&#39;environ 70% des gènes humains ont au moins un homologue de poisson-zèbre 4. Par exemple, de nombreux gènes orthologues qui jouent un rôle important au cours du développement du rein ont été identifiés entre ces espèces 5-7. Cette dradegré de conservation matic en ce qui concerne la biologie cellulaire et moléculaire ont permis aux chercheurs de créer des modèles pour un large éventail de maladies humaines chez le poisson zèbre 8, et le poisson zèbre sont devenus un outil précieux pour identifier les thérapies médicamenteuses potentielles en utilisant des écrans génétiques chimiques 9. En outre, le modèle de poisson zèbre est non seulement capable de récapituler une variété de processus complexes de développement et d&#39;états pathologiques qui sont vus dans l&#39;homme, mais plusieurs attributs supplémentaires accroître également son appel comme un organisme modèle pour les études embryologiques. Poisson zèbre sont ovipares et reproduire par la ponte de diffusion, qui fournit aux chercheurs un accès facile aux embryons dès le début de la fécondation 10. D&#39;autres avantages comprennent la taille de l&#39;embryon, la transparence, et le développement rapide externe 10. En outre, les adultes de poisson zèbre possèdent une fécondité élevée et produisent généralement des tailles relativement importantes d&#39;embrayage qui peut varier entre 200-500par semaine, en fin de compte permettre aux chercheurs de réaliser des expériences à haut débit, tels que les écrans chimiques phénotype base, avec la facilité 9. Même si, malgré la pléthore d&#39;avantages qui sont présentés par le modèle de poisson zèbre, il ya des défis qui se rapportent à l&#39;analyse et la communication des résultats expérimentaux obtenus à partir des stades de développement précoces. Dans certains cas, l&#39;anatomie inhérente de l&#39;embryon de poisson zèbre pourrait occulter la visualisation des données de l&#39;une. Après la fécondation, la cellule initiale subit de multiples événements de clivage au cours du développement 11. À la suite de la gastrulation, l&#39;axe embryonnaire émerge au stade de bourgeon caudal (10 hpf) de telle sorte qu&#39;elle est enroulée autour du jaune 11. Comme le développement ultérieur progresse à travers la période de segmentation, le tronc va croître en masse et aussi de prolonger par allongement axial de telle sorte que la queue le long d&#39;une partie du sac vitellin se prolonger à partir de la masse de jaune central11. Entre le bourgeon caudal et 20 stade de somites (19 HPF), les tentatives d&#39;observer les caractéristiques spécifiques de développement après l&#39;utilisation de différents protocoles de coloration, comme WISH, peut être difficile à la fois de visualiser et de photographier en raison de la géométrie de l&#39;embryon et de l&#39;opacité de le sac vitellin. Une façon d&#39;éliminer ces défis est d&#39;enlever le jaune puis aplatissez l&#39;embryon dans un échantillon à deux dimensions qui peut être analysée de manière plus simple. Les ressources de protocole et vidéo suivants fournissent un guide pour savoir comment deyolk succès et plat monter un embryon après fixation et coloration, en utilisant l&#39;exemple d&#39;une ou deux couleurs WISH coloration. WISH est une technique largement utilisée qui permet la détection d&#39;acides nucléiques spécifiques dans des échantillons conservés et permet pour le site (s) de l&#39;expression du gène à détecter au sein des tissus ainsi. techniques WISH ont été largement décrits et peuvent être réalisées avec différents substrats de couleurs ainsi que la grippesystèmes de détection orescent 12-20. Ici, nous offrons notre protocole de WISH modifié utilisé pour les embryons de poisson zèbre entre les étapes de bourgeon caudal et la segmentation de développement. Protocoles WISH alternatifs, cependant, sont compatibles avec la procédure plat montage décrit ici, comme indiqué au début du protocole ci-dessous. En outre, montage à plat pourrait être utilisé en conjonction avec un certain nombre de techniques de visualisation existants, comme tout immunohistochimie de montage, ou des étiquettes de suivi de la lignée cellulaire, qui ne sont pas décrites dans ce protocole. Dans l&#39;ensemble, la technique de montage à plat peut mieux permettre une meilleure analyse et la présentation des données obtenues à partir d&#39;expériences avec les premiers stades du développement embryonnaire chez le poisson zèbre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:163px;">50 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">1 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dilute 50 X E3 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:96px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:119px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:96px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">202, 204</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glass vial</td>
			<td style="width:96px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225012</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB11072</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430516</td>
			<td style="width:383px;">1L filter system, 0.45 um CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MeOH</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860-4L</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">proteinase K</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:383px;">Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">HYB+</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:383px;">Refer to manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11487671001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10881775001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11031171001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3335399001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycogen</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10901393001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:96px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">waterbath</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">51221073</td>
			<td style="width:383px;">Model 2831</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">nanodrop</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">formamide</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00600</td>
			<td style="width:383px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">20X SSC</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB13156</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">MAB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MABT</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">MAB + 0.1% Tween-20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:163px;">block solution</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 &#176;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &#176;C&#8212;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16140089</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00448</td>
			<td style="width:383px;">Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &#176;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:96px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-3225</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples)..</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">NBT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">INT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B8503</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00450</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycine</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:383px;">&#160;0.1 M glycine, pH 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7893</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">fine forceps</td>
			<td style="width:96px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:383px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:163px;">lash tool</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass slide</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:383px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass coverslip</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:383px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">modeling clay</td>
			<td style="width:96px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:383px;">Other craft modeling clay products can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">slide holder</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587-10</td>
			<td style="width:383px;">Cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">compound microscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i, 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

L&#39;embryon de poisson zèbre est maintenant couramment utilisé pour la recherche fondamentale et biomédicale pour étudier le contrôle génétique des processus de développement et de modéliser les anomalies congénitales. Au cours de la première journée de la vie, l&#39;embryon de poisson zèbre progresse dans de nombreux stades de développement, y compris la fertilisation, le clivage, la gastrulation, la segmentation et la organogenèse de structures tels que les reins, le coeur et le système nerveux central. L&#39;anatomie d&#39;un jeune embryon de poisson zèbre présente plusieurs défis pour la visualisation et l&#39;analyse des tissus impliqués dans un grand nombre de ces événements parce que l&#39;embryon se développe en association avec une masse jaune rond. Ainsi, pour une analyse précise et l&#39;imagerie des phénotypes expérimentales dans des spécimens embryonnaires fixes entre le bourgeon caudal et 20 stade de somite (10 et 19 heures après fertilisation (hpf), respectivement), telles que celles colorées en utilisant l&#39;ensemble de montage d&#39;hybridation in situ (WISH) dans, il est souvent souhaitable d&#39;éliminer l&#39;embryon à partir du jaune btout et pour le positionner à plat sur une lame de verre. Cependant, l&#39;exécution d&#39;une procédure de montage à plat peut être fastidieux. Par conséquent, la réussite et l&#39;efficacité de montage plat préparation est grandement facilitée par la mise en évidence visuelle de la technique de la dissection, et ont également contribué à l&#39;aide de réactifs qui facilitent la manipulation optimale des tissus. Ici, nous offrons notre protocole de souhaits pour la détection d&#39;une ou deux couleurs de l&#39;expression du gène dans l&#39;embryon de poisson zèbre, et montrons comment la procédure de montage à plat peut être effectuée sur cet exemple d&#39;un échantillon fixe colorées. Ce protocole de montage plane est largement applicable à l&#39;étude de nombreuses structures embryonnaires qui se dégagent au cours du développement précoce du poisson zèbre, et peut être mis en œuvre conjointement avec d&#39;autres méthodes de coloration effectués sur des échantillons d&#39;embryons fixes.

La procédure de protocole de montage plate implique la transformation de l&#39;embryon de poisson zèbre à partir de son anatomie normale, dans laquelle l&#39;axe du corps est enroulé autour d&#39;un ballon de jaune d&#39;oeuf situé au centre, dans une préparation à deux dimensions (Figure 1A). Tout le montage imagerie du jeune embryon de poisson zèbre est limitée par la nature de la façon dont l&#39;axe embryonnaire est enroulé autour du jaune. En conséquence, une vue latérale ou dorsale de l&#39;ensemble de montage des spécimens d&#39;embryons colorés ne peuvent capter une partie de l&#39;axe ou des tissus particuliers obscurs (figure 1B). Par comparaison, deyolking et aplatissement de l&#39;embryon permet l&#39;ensemble de l&#39;axe embryonnaire de visualiser à la fois (figure 1B). Ces limitations sont mises en évidence par l&#39;examen d&#39;un embryon de WISH souillé qui a été marqué avec ribosondes antisens pour détecter irx3b (violet), qui marque un sous-ensemble des progéniteurs rénaux situés à côté de somites 7 à 13, et MyoD1 (rouge) qui marque lasomites (figure 1B). Le champ de irx3b + rénales progéniteurs est obscurci dans l&#39;ensemble du montage vue latérale car transcriptions de irx3b sont abondants dans le système nerveux central, ce qui rend le domaine rénale pratiquement impossible à visualiser avec l&#39;angle de caméra latérale; en outre, le domaine de irx3b + progéniteurs rénales n&#39;est que partiellement visible lorsque l&#39;embryon est mis en rotation dans une vue de caméra dorsale parce que le champ est enroulé autour du jaune (figure 1B). Cependant, une vue dorsale du même embryon suivante montage à plat permet l&#39;ensemble du champ de irx3b + progéniteurs rénaux à analyser de manière simple par rapport aux somites sur le tronc et d&#39;autres structures embryonnaires (figure 1B). Ainsi, les domaines spatiaux élaborés peuvent être idéalement documentés avec cette méthode. Plusieurs étapes majeures sont impliqués dans l&#39;exécution réussie de la procédure de montage plat. Pour effectuer cette technique, la balle de jaune d&#39;oeuf doit être d&#39;abord détaché de l&#39;embryon proprement dit (figure 2A), ce qui peut être fait avec des instruments tels que des fines d&#39;une paire de pinces fines tandis que l&#39;embryon est visualisé en utilisant un stéréomicroscope. Après l&#39;élimination brut de la balle de jaune, un outil de cils amende est utilisé pour gratter granules de jaune qui sont restés attachés à l&#39;embryon (figure 2B). La suppression de granules de jaune d&#39;oeuf restantes permet de faciliter la visualisation des tissus embryonnaires. Enfin, l&#39;embryon deyolked est manipulé pour positionner de manière stable sur une lame de verre (figure 2C), ce qui permet l&#39;observation et des aides à la documentation de l&#39;échantillon en utilisant un logiciel de formation d&#39;image et une caméra fixée au microscope. Les outils cils sont des appareils faits maison qui peuvent être construits par l&#39;apposition d&#39;un coup de fouet adapté à une pointe de pipette à l&#39;aide colle, qui peuvent être montés sur une poignée si vous le souhaitez (figure 3A, table Matériaux). Échantillons de cils différents peuvent être obtenus à produirelash outils avec des caractéristiques légèrement différentes en termes de longueur et conique (figure 3B), qui chaque utilisateur peut avoir différentes préférences pour une fois qu&#39;ils commencent à expérimenter avec la procédure de montage plat. Des exemples d&#39;échantillons cils sont naturellement hangar cils humains, naturellement hangar cheveux ou moustaches nerveux animal, et enfin de variétés synthétiques de cils disponibles dans le commerce ont trouvé dans les départements cosmétiques détail. La région entourant et contenant l&#39;échantillon (s) placée sur une lame de verre (figure 4A) peut être imagée pour l&#39;analyse à haute résolution. Une combinaison de sondes ont été utilisés pour étiqueter les progéniteurs rénaux développement qui donnent naissance au rein dans le type sauvage embryon à des stades précoces du développement avec deux couleurs WISH, puis plat monter préparations ont été effectuées pour voir les échantillons (figure 4B, 4C ). Au cours des phases précoces des somites, les progéniteurs rénaux sont délimitées dans une courbe en forme de U par eexpression leu de transcriptions (pourpre) de PAX2A entourant le mésoderme paraxial qui exprime de façon concomitante delta C (dlc) (rouge) (colonne de gauche, figure 4B) 6,7. En comparaison, lorsque la transcription de DLC ont été détectées avec un substrat pourpre, et ont été marquées en combinaison avec la Krox20 marqueur cerveau postérieur (rouge), un sous-domaine rostrale des progéniteurs du rein a été visualisée qui exprime dlc (colonne de droite, la figure 4B), comme indiqué précédemment 6,7. Appartement monter préparations peuvent être utilisées de manière similaire à étudier les étapes de somitogenèse plus tard. Au stade de la somite 14, nous avons analysé l&#39;expression de marqueurs rénaux PAX2A, slc4a4, et slc12a3 (violet) avec smyhc1 (rouge), qui marque les somites (figure 4C). Ces combinaisons permettent la cartographie de l&#39;ensemble du domaine de progéniteurs avec PAX2A rénale, tout en révélant que un sous-ensemble de cellules dans une sous-domaine expr rostralEssed slc4a4a et se distinguaient par une caudale sous-domaine non-chevauchement des progéniteurs rénaux qui ont exprimé slc12a3. WISH deux couleurs et le montage préparation plat sont également précieux pour l&#39;étude des domaines cellulaires pendant l&#39;organogenèse chez le poisson zèbre à des mutations génétiques ou d&#39;autres perturbations de l&#39;exposition environnementale à de petites molécules 6,7 (figure 5). Les nls poisson zèbre et mutants lib abritent des mutations dans l&#39;aldéhyde déshydrogénase 1a2 (aldh1a2, anciennement connu sous le nom raldh2), qui code pour une enzyme nécessaire à la biosynthèse de l&#39;acide rétinoïque (RA). RA est essentielle pour le bon développement de plusieurs types de cellules rénales, y compris la formation de cellules de podocytes qui contribuent à rendre le filtre de sang du rein embryonnaire, appelée le glomérule 6,7. WISH a été réalisée pour marquer les progéniteurs podocytes avec wt1a en concomitance avec la démarcation de til somites développement avec smyhc1 cerveau postérieur et avec Krox20 dans des embryons de type sauvage, nls embryons mutants, des embryons mutants lib, et les embryons traités avec un inhibiteur de l&#39;enzyme ALDH chimique, DEAB (Figure 5). Embryons avec l&#39;expression de aldh1a2 déficient montré une expression de wt1a réduite par rapport aux embryons de type sauvage, alors que les embryons DEAB-traités ont montré une abrogation de transcriptions de wt1a (Figure 5, colonne de droite). Pris ensemble, ces résultats représentatifs montrent comment la technique de montage à plat peut être utilisé pour analyser et documenter les différences anatomiques avec précision dans l&#39;embryon précoce, et donc être mis en œuvre pour les études de développement de valeur. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la monter préparation platration pour embryons de poisson zèbre. A) La procédure de montage à plat permet l&#39;affichage simultané de tissus le long de l&#39;axe embryonnaire parce que la masse de jaune central est enlevé et l&#39;embryon positionnée de manière stable sur une surface plane. B) Images de toute une montagne SOUHAITENT embryon teinté en vue latérale et dorsale, et puis, après une préparation montage plat a été menée. L&#39;embryon a été coloré avec des sondes antisens pour détecter des transcrits de gènes codant irx3b (violet) et MyoD1 (rouge). <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma de la procédure de montage plat pour embryons de poisson zèbre. A) L&#39;embryon est d&#39;abord grossièrement deyolked pour enlever la majorité de la masse de jaune, puis (B) la surface ventrale est finement deyolked pour enlever restants granules de jaune, etaprès lavage de l&#39;embryon est (C) monté côté dorsal vers le haut sur ​​une lame de verre pour analyse visuelle et / ou une image photographique. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figure 3. Photographies de cils exemple les outils par rapport à une pince fine. A) les outils de cils faits maison ont été imagées à côté d&#39;une paire norme de pinces fines, positionnée adjacente à une règle métrique pour fournir une référence. B) La vue agrandie d&#39;outils cils à côté de la pince fine, avec la référence de millimètre prévu le long du haut de la vue . Deux outils de cils différents sont présentés, avec l&#39;astérisque (*) utilisé pour marquer le fouet obtenu à partir d&#39;un hangar naturellement cils humaine, et double astérisque (**) utilisé pour marquer un coup de fouet qui a été obtenu à partir d&#39;un hangar naturellement félin favori et coupé à faire une fin quelque peu émoussé. Dans chaque casoi, le fouet a été enfilé à travers la pointe de la pipette et fixée à l&#39;aide de plusieurs couches de colle de créer progressivement un joint solide pour stabiliser / ancrer le fouet à la pipette attaché à un dispositif de manipulation. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figure 4. Caractérisation des changements développementaux dans le domaine de l&#39;ancêtre rénale chez le type sauvage embryon de poisson zèbre. A) Faites glisser schématique indiquant la zone imagée pour analyse (B, C). B) des embryons de type sauvage à la 1, 3 et 5 stade de somites ont été colorées par deux couleurs souhaitent évaluer la composition du champ progénitrices rénale qui donne relever le rein embryonnaire, ou pronephros. (Colonne de gauche) transcrits codant pour le facteur de transcription PAX2A (teinté en violet) marquent plusieurs populations dans l&#39;embryon, dont le p rénalechamp rogenitor qui se dégage du mésoderme intermédiaire. Transcrits codant pour le ligand de Notch dlc marquent les somites qui se forment à partir du mésoderme paraxial (teinté en rouge). (Colonne de droite) Lorsque l&#39;expression des transcrits de dlc (colorées en violet) et le cerveau postérieur rhombomère marqueur Krox20 (teinté en rouge) sont examinées dans les mêmes embryons, expression dlc peut être observé dans un sous-domaine rostrale des progéniteurs rénaux situés à côté de somites 1-5, qui a été occulté pendant la co-coloration de dlc avec PAX2A. C) embryons de type sauvage au stade 14 somites sont double ou triple teinté avec une combinaison d&#39;un marqueur rénale (violet), le marqueur smyhc1 somites (rouge) , et le cerveau postérieur rhombomère marqueur Krox20 (aussi rouge). (Panneau supérieur) A ce stade, les transcriptions de PAX2A continuer à délimiter les progéniteurs rénaux. (Moyen-Orient, les panneaux inférieurs) Sur le territoire de l&#39;ancêtre rénale, un sous-domaine rostrale est marquépar slc4a4 et transcriptions qui codent slc12a3 marquer un sous-domaine caudale. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;utilisation de préparations montées à plat pour caractériser les phénotypes causés par des mutations génétiques ou de perturbations génétiques chimiques qui modulent la biosynthèse de l&#39;acide rétinoïque. Le motif de souhaits expression au stade 15 somites de wt1a (violet) et smyhc1/krox20 (rouge) ont été comparées entre les types sauvages et les embryons présentant des anomalies dans l&#39;acide rétinoïque (RA) de production en raison de défauts de l&#39;aldéhyde déshydrogénase 1a2 (nls et mutations lib) ou l&#39;inhibition chimique de retinaldehyde déshydrogénase avec diéthylaminobenzaldéhyde (DEAB). La réduction de la production de RA dans lib est légèrement plus sévère que nls, commeque les embryons lib expriment légèrement réduit la coloration des transcriptions de wt1a de mise en scène de la même nls embryons mutants, tandis que le traitement DEAB de types sauvages est associée à l&#39;abrogation complète de l&#39;expression wt1a.

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Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

L&#39;embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l&#39;embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d&#39;embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

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Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

24.1K vues.  University of Notre Dame.  L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson ...

Vidéo: Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Utilisation Mont entier<em&gt; In situ</emHybridation&gt; Lien vers biologie moléculaire et Organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...