Nous remercions la Société Max Planck, le Human Frontier Science Program (HFSP) et le Fonds Boehringer Ingelheim pour le financement et le soutien.

Une. Préparation du matériel <ol><li> Préparation de tubes FEP <ol><li> Nettoyez le tube FEP (figure 2A) par rinçage liquides (dans les étapes indiquées ci-dessous) à travers le tube et en utilisant une seringue attachée avec une extrémité émoussée canule (figure 2B) Note 1:.. Utiliser des gants tout au long de la procédure Note 2: Nous recommandons couper le tube en morceaux de ca. 1 m de longueur et de nettoyage celles en parallèle. <ol><li> Rincer d&#39;abord le tube avec 1 M NaOH à plusieurs reprises. Puis transférer le tube à un tube à centrifuger de 50 ml rempli de NaOH 0,5 M et ultrasonicate pendant 10 min. </li><li> Transférer le tube de polymère à un petit bassin avec le trou DDH 2 O. Rincer le premier tube avec le trou DDH 2 O et ensuite avec 70% EtOH. </li><li> Par la suite transférer le tube FEP dans un tube de centrifugeuse frais avec 70% EtOH. Encore une fois ultrasonicate ce tube à centrifuger pendant 10 min. </li></ol></li><li> Couper le tube FEP nettoyé en morceauxd&#39;environ 3 cm (une longueur typique pour une utilisation dans le montage de poisson zèbre et imagerie) et redresser si nécessaire. Stockez les tubes FEP nettoyés dans un tube de centrifugeuse de 50 ml frais rempli de trou DDH 2 O (figure 2C). </li></ol></li><li> Préparation de Tricaine solution stock <ol><li> Préparer la solution Tricaine des stocks de 0,4% en dissolvant 400 mg Tricaine (MS-222) dans le trou DDH 2 97,9 ml O. Après la dissolution complète de la poudre, ajuster le pH à 7,0 en utilisant 2,1 ml de Tris 1 M (pH 9,0). Protéger la solution de la lumière. aliquotes de conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Préparation de 3% de méthylcellulose <ol><li> Préparer une solution de méthylcellulose à 3% pour le revêtement intérieur des tubes FEP comme décrit ci-dessous. Chauffer E3 11 dans une bouteille en verre à environ 60 à 70 ° C et ajouter la quantité appropriée de poudre de méthylcellulose. Ajouter une barre d&#39;agitation et agiter à 4 ° C. Dès que la solution est refroidie en dessous de 30 ° C, ajouter la solution à un Tricaine c finaleoncentration de 100 mg / L. Gardez en remuant à 4 ° C pendant la nuit. </li></ol></li><li> Préparation de 1,5% et 0,1% d&#39;agarose dans E3 <ol><li> Dissoudre la quantité appropriée de poudre d&#39;agarose à bas point de fusion dans un volume défini d&#39;E3 dans un flacon en verre. Chauffer le mélange dans un micro-ondes et le secouer de temps en temps, jusqu&#39;à ce que la solution d&#39;agarose apparaît homogène, sans cristaux restants. </li><li> Préparer aliquotes de 1 ml de solution d&#39;agarose à 0,1% dans 1,5 ml de tubes de réaction. Les aliquotes peuvent être stockées à 4 ° C. </li><li> Utiliser la solution à 1,5% de revêtir une boîte de Pétri en matière plastique. L&#39;épaisseur de la couche d&#39;agarose doit être ca. 2 mm. Après l&#39;agarose est solidifiée, ajouter du milieu E3 sur le dessus de la couche pour l&#39;empêcher de sécher. Le plat revêtu peut être stocké à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparation de poisson-zèbre <ol><li> Gardez le poisson zèbre (Danio rerio) adultes et d&#39;embryons à 28,5 ° C et de les gérer selon les protocoles établis 11,12. </li><li> Mettre en place le poisson mâle et femelle dans l&#39;après-midi et les séparer à l&#39;aide d&#39;un diviseur. Enlevez le séparateur, le lendemain matin à autre l&#39;accouplement des poissons. </li><li> Recueillir les embryons dans un plat rempli d&#39;E3 et de les examiner à l&#39;aide d&#39;un microscope stéréoscopique. </li><li> À 24 HPF (ou le stade de développement de votre intérêt), sélectionnez l&#39;embryon de poisson zèbre pour l&#39;expression de la fluorescence et de transférer les aspects positifs à un nouveau plat avec E3 frais. </li><li> Dechorionate attentivement les embryons en utilisant deux pinces acérées (figures 2D et 2E). Utilisez les premières pinces pour saisir et tenir le chorion et la deuxième pince pour arracher ouverte et retirer Note 1:. Effectuez cette étape à l&#39;aide d&#39;une loupe binoculaire. </li></ol></li></ol> 2. Multicouche de montage <ol><li> Revêtement du tube de FEP <ol><li> Attacher une extrémité canule émoussée à une seringue. Insérez la canule attentivement pendant environ 3 mm à une extrémité d&#39;un nettoyage et couper le morceau de. Tubes FEP (figures 2F et 2G) Note 1: Utiliser des gants et éviter toute flexion ou compression du tube. </li><li> Trempez l&#39;extrémité libre du tube FEP dans 3% de méthylcellulose et remplir le tube avec la solution. </li><li> Relâchez lentement la méthylcellulose en poussant sur la seringue. Jeter la solution. </li><li> Répétez les étapes 2.1.2 et 2.1.3 en utilisant E3 Note 1:. Les tubes revêtus doivent être utilisés pour le montage immédiatement. </li></ol></li><li> Transfert du poisson zèbre à l&#39;agarose <ol><li> Chauffer une partie aliquote de 0,1% d&#39;agarose à 70 ° C dans un bloc chauffant. Vortex brièvement le tube de réaction et de le transférer à un bloc chauffant à 38 ° C (figure 2H). </li><li> Prenez le tube de réaction à partir du bloc de feu et laisser refroidir brièvement. Ajouter Tricaine à une concentration finale de 133 à 200 mg / L et de vortex à nouveau (figure 2I). </li><li> Sélectionnez l&#39;une des embryons de poisson zèbre dechorionated et transfe. r au tube de réaction avec le four préchauffé à 0,1% d&#39;agarose en utilisant une pipette Pasteur en verre (figures 2J et 2K) Note 1: Essayez de transférer aussi peu supplémentaire E3 que possible. </li></ol></li><li> Montage du poisson zèbre <ol><li> Prenez l&#39;embryon avec le tube de seringue FEP-jointe (figure 2L). . Le tube doit être complètement rempli avec 0,1% d&#39;agarose, avec l&#39;embryon placé près de la fin du tube et avec la tête tournée vers l&#39;ouverture du tube Note 1: Assurez-vous de prendre un peu d&#39;agarose avant de prendre le poisson. Note 2: Tirez très doucement sur ​​la seringue pour éviter les bulles Note 3:. Garder le tube dans une orientation horizontale pour éviter les fuites de son contenu (figures 2M et 2N). </li></ol></li><li> Brancher le tube <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Multicouche de montage pour les embryons de poisson zèbre. A) d&#39;éthylène-propylène fluoré (FEP) tubes sur un tambour à câble avant la préparation. B) Une seringue avec une extrémité canule émoussée ci-joint. C) Un nettoyés et coupés FEP tube. D, E) dechorionation de 24 HPF embryons de poisson zèbre. F) Fixation du tube à l&#39;extrémité canule émoussée. G) La seringue avec canule et le tube-joint. H) Une portion aliquote de 0,1% d&#39;agarose dans un tube de réaction tout en les transférant sur ​​un bloc chauffant. I) vortex du fondu agarose. J) Absorption d&#39;un embryon dechorionated en utilisant une pipette en verre. K) de transfert de l&#39;embryon dans l&#39;agarose fondu. L) de réception de l&#39;embryon avec entourant agarose dans le tube en FEP. M, N), l&#39;embryon de poisson zèbre à l&#39;intérieur du tube FEP . <strong&gt; O) coupe le tube entre l&#39;échantillon et la canule. P) Brancher le tube par l&#39;utilisation d&#39;un plat d&#39;agarose revêtues. Q) L&#39;embryon à l&#39;intérieur du tube branché. R) La préparation finale de l&#39;échantillon dans un support métallique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <ol><li> Utilisez une lame de rasoir pour couper le tube de la canule (Figure 2O). </li><li> Coller lentement l&#39;extrémité du tube contenant le poisson à travers la totalité de la couche de 1,5% d&#39;agarose dans le plat en plastique pour boucher le tube (Figure 2P) Note 1:. Eviter la formation de bulles et essayer d&#39;obtenir une surface de prise droite en tenant le . Tube exactement perpendiculaire à la surface de la gélose Note 2: Tournez légèrement le tube pour obtenir une belle prise. </li><li> Garder le spécimen monté dans un tube de réaction de 1,5 ml avec de l&#39;E3 pour éviter le séchage. L&#39;échantillon est now prêt à imager. Avant imagerie, vérifier si le poisson est assis juste au-dessus du bouchon (figures 2T et 2R). Assurez-vous aussi d&#39;ajouter Tricaine au milieu intérieur de la chambre d&#39;imagerie à la même concentration que dans le milieu de montage. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Techniques de microscopie de pointe telles que la microscopie de nappe de lumière nous permettent d&#39;enregistrer des données d&#39;image avec une résolution spatiale et temporelle au cours de plusieurs jours, mais aussi nécessitent des techniques de montage d&#39;échantillons à améliorer. Nous présentons un protocole détaillé de multicouche de montage pour la microscopie nappe de lumière de développement du poisson zèbre. La méthode est simple à mettre en œuvre et nous l&#39;utilisons dans notre laboratoire sur une base quotidienne. Les tubes FEP Les éléments clés de notre stratégie de montage sont des tubes en l&#39;éthylène propylène fluoré polymère (FEP). Nous avons décidé d&#39;utiliser FEP principalement en raison de son indice de réfraction de 1,338, ce qui est similaire à l&#39;eau et donc parfaitement adapté pour la microscopie nappe de lumière avec les objectifs de l&#39;eau de trempage et de spécimens nécessitant des milieux aqueux. Les tubes de 0,8 mm de diamètre intérieur et de 0,4 mm d&#39;épaisseur de paroi adapter le poisson zèbre développe très bien, peuvent être utilisés avec des porte-échantillons typiques adaptés à 1,6 mmcapillaires et sont notre premier choix pour la méthode de fixation présenté. Nous avons testé à fond dans nos configurations assemblés ainsi que dans le système commercial &quot;Lightsheet Z.1&quot; par Carl Zeiss Microscopie et constaté que les tubes FEP offrir une stabilité à long terme, avoir qu&#39;un impact minimal sur les performances optiques et sont non fluorescent 10. Ils sont, cependant, ne conviennent pas pour des applications avec des échantillons qui nécessitent un indice de réfraction différent, par exemple effacé spécimen. Les tubes ainsi que des feuilles faites de FEP sont disponibles dans une variété de diamètres et épaisseurs. En outre, le FEP peut être fondu à 260 ° C et offre des possibilités quasi infinies pour l&#39;échantillon des supports de montage sur mesure ainsi. Les tubes de polymère ont tendance à être fourni non stérile, ce qui explique pourquoi le protocole de nettoyage comprend plusieurs mesures pour assurer la meilleure qualité optique. Le revêtement avec de la méthylcellulose garantit qu&#39;aucune partie de l&#39;embryon de poisson zèbre croissante colle au polymère. La décision pour 0,1% d&#39;agarose est basée sur des tests approfondis de taux et de l&#39;immobilité de croissance à différentes concentrations de l&#39;agarose et la méthylcellulose 10. Concentrations supérieures à 0,1% d&#39;agarose ont déjà montré un impact grave sur le taux de 24 HPF poisson zèbre de croissance. En outre, nous utilisons de faibles doses de la drogue anesthésiante Tricaine. les potentiels des blocs de tricaïne d&#39;action, inhibe ainsi la transmission des signaux entre le cerveau et les muscles et supprime les contractions musculaires 16. Une concentration de 133 à 200 mg / L assure l&#39;immobilisation suffisante de poisson zèbre entre 24-72 HPF. Cependant, Tricaine et d&#39;autres médicaments anesthésiants nous avons testé les effets secondaires dépendent spectacle de doses telles que l&#39;oedème cardiaque. En outre, la dose requise de tricaïne varie avec le stade de développement de l&#39;embryon. Nous recommandons donc de réduire la concentration Tricaine à la quantité nécessaire pour les stades de développement qui sont imagés. Pour assurer la meilleure performanCE et éviter la formation de sous-produits toxiques, solution stock Tricaine fraîchement préparée ou décongelé doit être utilisé, protégé de la lumière et non chauffé au-dessus de 30 ° C. L&#39;intégration dans des tubes FEP permet également de modifier facilement le milieu de montage pour tenir compte des besoins spécifiques. Pour l&#39;imagerie time-lapse du cœur, nous vous recommandons d&#39;utiliser 3% de méthylcellulose et 100 mg / L Tricaine au lieu de 0,1% d&#39;agarose et 200 mg / L pour le montage. La méthylcellulose est plus visqueux que 0,1% d&#39;agarose fournissant ainsi l&#39;immobilité plus haut sur sa propre tricaïne et moins qui doit être utilisé pour assurer le confinement de l&#39;embryon. Tricaïne est sensible à des températures supérieures à 30 ° C et peut également être diluée par le fluide dans la chambre d&#39;imagerie, ce qui conduit à une baisse des performances et des contractions possible de l&#39;embryon. Par conséquent, assurez-vous d&#39;utiliser Tricaine également dans le milieu de l&#39;imagerie dans lequel le spécimen monté est immergé. Si les expériences nécessitent l&#39;utilisation ultérieure detempératures, il est recommandé changeant le milieu dans la chambre d&#39;imagerie soit constamment en utilisant un système de perfusion ou manuellement avec un tube et une seringue entre deux points dans le temps. Les étapes critiques Les étapes critiques au cours du processus de montage de l&#39;échantillon sont l&#39;admission de l&#39;échantillon dans le tube et l&#39;insertion du bouchon d&#39;agarose. L&#39;apport définit la position initiale de l&#39;embryon, qui est encombrant pour changer par la suite. Spécimens multiples devraient être disponibles pour monter et la qualité de montage doivent être surveillées avec une loupe binoculaire. Si l&#39;orientation de l&#39;échantillon n&#39;est pas satisfaisante, la modification de la vitesse de l&#39;élaboration de l&#39;échantillon et éviter les mouvements ultérieurs du plongeur peut aider que ce tord souvent l&#39;embryon. Le bouchon d&#39;agarose à 1,5% est nécessaire pour éviter les fuites de l&#39;agarose à 0,1%. La surface de la fiche à l&#39;intérieur du tube doit être plat pour ne pas influencer l&#39;orientation de l&#39;échantillon au cours du développement. Pour atteindre un bon surfas, différentes épaisseurs des couches d&#39;agarose doivent être testés et le tube doit être mis dans l&#39;agarose normale à la surface. Tourner le tube un peu et en tirant le tube libère attentivement la fiche de l&#39;antenne. La qualité du montage doit être vérifiée avec un stéréomicroscope avant l&#39;imagerie. imagerie de Multiview Un avantage majeur de la microscopie à feuille de lumière est l&#39;imagerie multi-vues, la capacité de faire tourner l&#39;échantillon, acquérir z-piles sous des angles multiples et ensuite enregistrer et de les fusionner. Une méthode établie pour enregistrer les z-piles dans l&#39;espace 3D est l&#39;enregistrement sur ​​la base de perles en utilisant des billes fluorescentes autour de l&#39;échantillon en tant que marqueurs fiduciaires 17. Cette méthode repose toutefois sur un support de montage solide tel que 1,5% d&#39;agarose et semble donc incompatible avec le multicouche montage présenté ici. Mais plusieurs solutions alternatives fonctionnent selon l&#39;application. Tout d&#39;abord, les perles fluorescentes peutdoit être intégré dans le bouchon d&#39;agarose, qui doit être dans le champ de vision au cours de l&#39;acquisition. D&#39;autre part, les positions de la scène peuvent être étalonnés avant les expériences réelles en utilisant une colonne d&#39;agarose à 1,5% avec des billes fluorescentes. Troisièmement, les marqueurs de substitution tels que les noyaux fluorescents peuvent être utilisés pour identifier la position des empilements z par rapport à l&#39;autre. Évaporation Typiques des configurations de microscopie nappe de lumière utilisent une chambre d&#39;échantillon ouvert, qui conduit inévitablement à l&#39;évaporation du milieu. Depuis le milieu est essentiel pour la survie de l&#39;échantillon, pour limiter l&#39;évaporation du milieu de montage et de l&#39;indice de réfraction correcte entre l&#39;optique et de l&#39;échantillon, nous recommandons de prendre une ou plusieurs des mesures suivantes pour éviter l&#39;évaporation. Tout d&#39;abord, le milieu dans la chambre peut être échangée en permanence par un système de perfusion. En second lieu, le milieu peut être rempli manuellement. En troisième lieu, la chambre peut être recouvert d&#39;un couvercle ou d&#39;une feuille flexible. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; fourniture d&#39;oxygène Le FEP de polymère a été mise au point pour résister à une grande variété de produits chimiques et est donc robuste, chimiquement inerte et non perméable au gaz. Dans le cas de plusieurs couches de montage oxygène ne peut pénétrer à travers le bouchon d&#39;agarose et l&#39;interface agarose-air, mais il reste à démontrer si l&#39;apport d&#39;oxygène dans le montage multicouche est fortement inférieur à celui de monter à 1,5% d&#39;agarose sans tube support polymère. Cependant, comme dans le montage de 1,5% d&#39;agarose ne peut être utilisé pendant environ deux heures avant la morphologie du poisson zèbre est affectée montage multicouche semble être la meilleure solution globale pour l&#39;imagerie à long terme. Imagerie premiers stades de développement Multicouche de montage est devenu notre technique d&#39;encastrement standard pour feuille de lumière time-lapse microscopie de poisson zèbre âgés de plus de 24 HPF. En plus de cela, nous utilisons également des tubes de polymères pour l&#39;imagerie des embryons de stade précoce. L&#39;embryos restent dans leurs chorions et sont montés dans un tube en FEP avec un diamètre interne de 1 mm et remplis de E3. Le poisson zèbre peut développer librement à l&#39;intérieur du chorion et peut encore être imagé bien en utilisant la microscopie nappe de lumière. Perspective Le montage de l&#39;échantillon multicouche présenté libère le plein potentiel de la microscopie à feuille de lumière en temps réel la biologie du développement avec le poisson zèbre. Il peut facilement être adoptée pour d&#39;autres techniques de microscopie comme la tomographie à projection optique (OPT) et d&#39;autres organismes. Nous croyons que les tubes FEP taille standard ne sont que les premiers pas vers les techniques de montage d&#39;échantillons sur mesure pour des besoins spécifiques.

Pour comprendre les événements complexes et des interactions au cours de l&#39;embryogenèse, la recherche en biologie du développement est de plus en plus mobile de la microscopie de cellules et d&#39;organes simples à l&#39;imagerie in vivo d&#39;organismes entiers. Les techniques traditionnelles de microscopie ne généralement à offrir la résolution spatiale et temporelle de suivre les événements rapides sur une longue période de temps et provoquent le blanchiment ou les effets phototoxiques de l&#39;échantillon 1 souvent. Nous et d&#39;autres avons trouvé microscopie nappe de lumière (figure 1) soit la technique idéale pour l&#39;imagerie in vivo de poisson zèbre 2-4. L&#39;illumination de l&#39;échantillon avec une feuille mince de lumière laser, orthogonal à l&#39;axe de détection, propose un sectionnement optique rapide à haute résolution spatiale réduite au minimum ainsi que la photo-toxicité 5. Dans le même temps, en raison de cet agencement optique unique, les techniques de montage d&#39;échantillon traditionnels utilisant des boîtes de Pétri ou des chambres de culture ne sont pas adaptés. Dans une lumière typiquefeuille microscope trois moteurs de translation et de rotation d&#39;un moteur détiennent l&#39;échantillon, de telle sorte qu&#39;il peut être positionné avec précision, tournés et visualisées à partir de n&#39;importe quelle direction. Dans les spécimens dernières pour la microscopie nappe de lumière ont souvent été embarqué dans 1-2% d&#39;agarose dans un capillaire en verre 6,7. Dans ce cas, le cylindre d&#39;agarose solidifié avec l&#39;échantillon embarqué est extrudée hors du tube capillaire en verre dans la chambre de mesure remplie de l&#39;eau comme milieu de formation d&#39;image. Agarose a un indice de réfraction proche de l&#39;eau et est donc parfaitement adapté pour la microscopie nappe de lumière in vivo qui facilite l&#39;optique d&#39;illumination et de détection corrigé à l&#39;eau. L&#39;échantillon est confiné dans l&#39;agarose rigide et peut être bien imagée pour une courte période de temps, mais les changements morphogénétiques et la croissance de l&#39;embryon sont fortement compromise lors de l&#39;imagerie pendant plusieurs heures 7,8. Bien que des solutions pour d&#39;autres applications ont été développées 9, la non invasive à long terme time-lapse de poisson zèbre<html> potentiel de formation d&#39;image de microscopie à nappe de lumière ne peut pas être exploitée en utilisant le plongement classique d&#39;agarose à 1,5%. Nous avons donc développé une nouvelle stratégie de montage pour la microscopie nappe de lumière in vivo des embryons de poisson zèbre 10. L&#39;échantillon est monté dans 0,1% d&#39;agarose avec 200 mg / L Tricaine l&#39;intérieur d&#39;un tube en polymère fluoré d&#39;éthylène optiquement clair propylène (FEP). L&#39;embryon se développe normalement intégré raison de la faible viscosité du milieu. Dans le même temps, le tube FEP confine le support et l&#39;échantillon pour la durée de l&#39;expérience. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la nouvelle technique de montage et présenter des données reflétant ses avantages sur le protocole classique. Nous démontrons que notre méthode de développement du poisson zèbre peut être imagée en continu avec une résolution spatiale et temporelle sur une période de plus de deux jours. 5po &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Le principe de la microscopie de nappe de lumière. Un poisson zèbre monté dans un tube en éthylène propylène fluoré (FEP) peut être traduit et mis en rotation à travers le plan focal de l&#39;objectif de détection. Une mince feuille de lumière laser (nappe de lumière) est projetée par l&#39;objectif d&#39;éclairage dans le plan focal de l&#39;objectif de détection et illumine seulement une section optique mince de l&#39;échantillon. Le signal de fluorescence émise est collectée par l&#39;objectif de détection et enregistrée sur une puce de caméra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

Feuille microscopie optique est la technique d&#39;imagerie idéal pour étudier le développement embryonnaire du poisson zèbre. En raison de la photo-toxicité et blanchiment minime, il est particulièrement adapté pour l&#39;imagerie time-lapse à long terme sur plusieurs heures jusqu&#39;à plusieurs jours. Cependant, une stratégie de fixation appropriée de l&#39;échantillon est nécessaire qui offre à la fois le confinement et le développement normal de l&#39;échantillon. Multicouche de montage, une nouvelle technique d&#39;enrobage à l&#39;aide de faible concentration d&#39;agarose dans des tubes optiquement transparents, surmonte maintenant cette limitation et libère le plein potentiel de la microscopie à feuille de lumière en temps réel la biologie du développement.

Imagerie Etapes de poisson zèbre Vasculature développement Nous utilisons une dpf Tg (kdrl: GFP) 13 poisson zèbre pour démontrer les avantages de la stratégie de montage multicouche pour microscopie optique de la feuille à long terme. Le but est la mise au point de l&#39;image de la vascularisation dans l&#39;ensemble du poisson zèbre-dessus d&#39;un espace de 2 jours. L&#39;embryon de poisson zèbre a été montée dans 0,1% d&#39;agarose dans un tube de polymère de méthylcellulose revêtue. Ici, le poisson zèbre ne soit pas limitée par le moyen de fixation et peut se développer normalement. Sa tête soulève, la queue s&#39;étend et germination vasculaire semble pas gênée (Figure 3). <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figure 3. D&#39;imagerie Etapes de développement du système vasculaire du poisson zèbre. Le système vasculaire d&#39;un multilatéralesyer monté 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 poisson zèbre se développe sans entrave dans une feuille microscope optique au cours de deux jours. Une feuille de lumière laser de 488 nm de la fluorescence excitée et le signal a été détecté en utilisant 10X/0.3 W objectif et une caméra EMCCD. Z-piles ont été acquises sur quatre positions adjacentes toutes les 10 min, puis cousues avec les Fidji 15. Projections maximales d&#39;intensité d&#39;un sous-ensemble de points de temps sont affichés. Barre d&#39;échelle:. 500 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Imaging of Early poisson zèbre embryogenèse Ici, nous démontrons la capacité de tubes FEP comme un support de montage pour la microscopie nappe de lumière de début de l&#39;embryogenèse du poisson zèbre pendant le premier jour après la fécondation. Le 8 HPF Tg (H2A: GFP) 14 embryon de poisson zèbre a été monté avec son chorion intacte à l&#39;intérieur d&#39;un tube E3-rempli avec un idiamètre de nner de 1 mm. Cela se traduit par un léger serrage du chorion. Tous les processus de développement au cours de l&#39;embryogenèse ne sont pas affectées par le montage et peuvent être visualisées de façon optimale en utilisant la microscopie nappe de lumière. Dans cet exemple, nous imager l&#39;échantillon sur un parcours de 12 heures (Figure 4). Changements de forme au cours de l&#39;embryogenèse précoce typiques, tels que l&#39;augmentation de l&#39;allongement du jaune et de l&#39;épaississement de tissu le long de la ligne médiane, seraient oppression lors de l&#39;utilisation du montage traditionnel sans chorion dans 1,5% d&#39;agarose. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figure 4 Imaging de début de l&#39;embryogenèse du poisson zèbre Un Tg (H2A: GFP). 14 poisson zèbre traverse l&#39;embryogenèse précoce. Une GFP excitée en feuille de lumière laser de 488 nm et le signal de fluorescence a été détectéeavec un objectif de 10X/0.3 W et une caméra EMCCD. Z-piles de deux angles ont été acquis toutes les 3 min sur un parcours de 12 heures. Projections d&#39;intensité maximale normalisée d&#39;un sous-ensemble de la time-lapse sont présentés. Visible flou de mouvement à 19 HPF résultats de l&#39;contractions embryon lors de l&#39;acquisition, aucune anesthésie ont été utilisés. Barre d&#39;échelle:. 150 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

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Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Le développement de poisson zèbre peut être suivie au fil des jours avec la microscopie nappe de lumière lorsque les embryons sont incorporés dans des tubes de polymères optiquement transparents à faible concentration d&#39;agarose.

Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.7K vues.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Le développement de poisson zèbre peut être suivie au fil des jours avec la microscopie nappe de lumière lorsque les embryons sont incorporés dans des tubes de polymères optiquement transparents à faible concentration d'agarose. 

Vidéo: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Recherche

Biologie

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Application de résine photopolymérisable adhésif dentaire pour les électrodes de montage ou des sondes de microdialyse dans les expériences chroniques

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Configuration d&#39;une nappe de lumière Microscope simple pour<em&gt; En Toto</em&gt; Imagerie de<em&gt; C. elegans</em&gt; Développement

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Fiche Fluorescence Microscopy Lumière de racines de plante qui pousse sur la surface d&#39;un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, une méthode pour monter la larve de Drosophila pour l’imagerie à long terme de time-lapse

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.