Ce travail a été soutenu par R01 DC013339, R03 DC011373, et Ruth L. Kirschstein Service national de la recherche Prix T32 DC000014. Une partie des travaux a été réalisée en utilisant le Monell Chemosensory signalisation des récepteurs de base, qui est pris en charge, en partie, par le financement de la P30 DC011735 NIH-NIDCD base Grant. Les auteurs remercient C. Sézille de l&#39;aide à la collecte de données.

1. Culture de cellules Hana3A <ol><li> Préparer des milieux M10 en complétant le milieu essentiel minimum (MEM) avec 10% (v / v) de FBS. </li><li> Culture Entretien <ol><li> Maintenir les cellules dans les médias M10. REMARQUE: Les vecteurs d&#39;expression pour RTP1L, RTP2, REEP1, et G αolf confèrent une résistance à la puromycine à cellules Hana3A, mais le maintien des cellules avec cet antibiotique n&#39;affecte pas significativement les résultats du dosage. </li><li> Subculture à un rapport de 1:8 en boîtes de 10 cm tous les 2-3 jours. </li><li> Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Cellules de placage pour la transfection <ol><li> Aspirer le milieu d&#39;une confluence de 10 cm de cellules Hana3A 100%. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 10 ml de PBS, tourner le plat, et aspirer le PBS. </li><li> Ajouter 3 ml de 0,05% de trypsine / EDTA et attendre pour que les cellules se dissocient (environ 1 min). </li><li> Inactiver la trypsine en ajoutant 5 ml de M10 et de briser les mottes de cellules par trituration environ 10x &amp;# 160; avec une pipette de 10 ml. Pipette avec précaution pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans les médias. </li><li> Pour chaque plaque à 96 puits, le transfert de 1 ml de cellules dans un tube conique de 15 ml, centrifuger à 200 g pendant 5 min, et aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 6 ml de M10 par 1 ml de cellules transférées à l&#39;étape 2.5. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul de cellules à chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> 3. Transfection de récepteurs olfactifs <ol><li> Préparation d&#39;ADN plasmidique <ol><li> Préparer l&#39;ADN de plasmide par l&#39;intermédiaire d&#39;un protocole sans endotoxine. NOTE: L&#39;utilisation des kits de préparation d&#39;ADN plasmide désigné «exempt d&#39;endotoxine&quot;, ou ajouter une étape d&#39;extraction au phénol-chloroforme pour le protocole de préparation de l&#39;ADN plasmidique. </li><li> Diluer l&#39;ADN jusqu&#39;à une concentration de 100 ng / ul dans du tampon TE. </li></ol></li><li> Respecter les cellules étalées (étape 2.7) pour assurer une bonne confluence de rapprochementTely 30-50% par puits et retourner à l&#39;incubateur. REMARQUE: Bien que ce confluence n&#39;est pas optimal pour le réactif de transfection lipide, une confluence de 30 à 50% à cette étape est optimale pour la mesure de l&#39;activité de luciférase 24 heures après transfection. </li><li> Préparation du mélange de transfection <ol><li> Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc, et pSV40-RL plasmides dans du milieu MEM par les volumes détaillés dans le tableau 1 pour rendre le mélange plasmide (volumes indiqués sont par plaque de 96 puits). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> Plasmide mélange </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> par puits </td><td> par plaque de 96 puits </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 pl </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2,5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> pCRE-luc </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Plasmide composants de mélange. Par puits et par des volumes de plaques à 96 puits de RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc, et pSV40-RL, et MEM. </li><li> Pour chaque plaque à 96 puits, diluer 18 ul de réactif de transfection lipide dans 450 ul de milieu MEM. </li><li> Pipette plasmide mélange (étape 3.3.1), la rhodopsine marqués récepteur olfactif dans pCI plasmide (Rho-OU-PCI), et des lipides mélange de transfection (de l&#39;étape 3.3.2) pour rendre le Complexe détaillée dans <strong&gt; Tableau 2. Mélanger la solution par trituration et incuber à température ambiante pendant 15 min. Arrêter la réaction en ajoutant M10 selon le tableau 2. REMARQUE: cette réaction est sensible au temps et ne devrait pas être autorisé à poursuivre pendant plus de 30 min. Le puits + 10% calcul est important de s&#39;assurer un volume suffisant pour les étapes suivantes. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> Complexe </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> par puits </td><td> par puits + 10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Plasmide mélange </td><td> 4,2 pl </td><td> 4,58 pi </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-OU-PCI </td><td> 0,05 ng </td><td> 0,06 ng </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> Transfection lipide mélange </td><td> 4,2 pl </td><td> 4,58 pi </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41,7 pi </td><td> 45.83 pi </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Des composants complexes par puits et par puits + 10% des volumes de mélange plasmide (tableau 1), le plasmide de récepteur olfactif (Rho-OU-pCI), et la transfection lipide mélange.. M10 est ajouté pour arrêter la réaction après une incubation de 15 min à température ambiante. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Appuyez sur les médias sur les plaques de la cellule. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul de complexe à chaque puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> 4. Odeur Stimulation <ol><li> Respecter les cellules transfectées pour assurer une bonne confluence de 50-80% par puits et retourner à l&#39;incubateur. Remarque: si des cellules sont à moins de 50% Confluentes, la luciférase de luciole et la luciférase de Renilla lectures peuvent être trop faible pour la mesure de l&#39;activation du récepteur. Considérez jeter la plaque. </li><li> Préparer une M d&#39;solutions de chaque odeur dans le DMSO. </li><li> Préparer des solutions de stimulation des odeurs en milieu CD293. <ol><li> Pour les expériences de dépistage, diluer la solution mère de l&#39;odeur à 100 um. Préparer aussi un contrôle sans odeur (CD293 uniquement) afin de contrôler ou de l&#39;activation de fond. NOTE: Pour les expériences de dépistage, chaque paire OU / odeur est testé une seule fois par l&#39;expérience. Parce que certains diffusion des odeurs à travers les puits est possible, il est recommandé de stimuler avec une substance odorante pour chaque plaque. </li><li> Pour les expériences de dose-réponse, préparer sept 10 dilutions en série de solution odeur de stock en trois exemplaires à partir de 1 mM pour chaque récepteur. Préparer également les mêmes dilutions d&#39;odeur, en triple exemplaire pour les cellules transfectées par un vecteur vide, afin de contrôler l&#39;odeur de l&#39;activation d&#39;arrière-plan. NOTE: Pour les expériences de dose-réponse, chaque otraitement de concentration de dor devrait être effectuée en triple. </li></ol></li><li> Appuyez sur les médias sur les plaques de la cellule. </li><li> Pipette 25 ul de solution de stimulation de l&#39;odeur à chaque puits et incuber pendant 4 heures. </li></ol> 5. Mesure ou une activité par dosage de luciférase <ol><li> Remettre en suspension substrat luciférase de luciole par les instructions et magasin du fabricant à -80 ° C. </li><li> Décongeler 1 ml de substrat de la luciférase de luciole par plaque de 96 puits. </li><li> Préparer réaction luciférase de luciole frais quencher et la luciférase de Renilla réactif de substrat (5 ul luciférase quencher / Renilla luciférase de substrat pour 1 ml de tampon). REMARQUE: Environ 1 ml de réactif est nécessaire par plaque de 96 puits. </li><li> Préparer le lecteur luminescent de microplaques. Ouvrez le logiciel de lecteur de microplaques. Dans l&#39;icône du système: <ol><li> Dans le cadre du &quot;pré-chauffage&quot; Tab, cochez la case &quot;ON&quot; et régler la température de la machine à 25 °; C. </li><li> Sous l&#39;onglet «distributeur», le premier de chaque distributeur avec 1000 ul de 70% d&#39;éthanol suivie par 1 000 pi d&#39;eau distillée. REMARQUE: Utilisez des portions séparées de l&#39;alcool et de l&#39;eau pour chaque distributeur. L&#39;éthanol est utilisé pour désinfecter les distributeurs, et de l&#39;eau élimine l&#39;éthanol résiduel. </li><li> Premier distributeur de chaque 1500 pi de l&#39;air (supprimer les distributeurs de liquide). REMARQUE: amorçage avec de l&#39;air assure que les substrats de luciférase sont pas dilués avec de l&#39;eau résiduelle. </li><li> Premier distributeur 1 avec 1080 ul de substrat de la luciférase de luciole (de l&#39;étape 5.2). Premier distributeur 2 avec Renilla substrat de la luciférase (de l&#39;étape 5.3). REMARQUE: Veillez à ne pas contaminer les substrats de luciférase. Amorçage avec des substrats de luciférase remplit l&#39;espace mort dans les distributeurs de réactifs. </li></ol></li><li> Mettre en place le protocole suivant pour lire à la fois luciole et de Renilla luminescence. Dans le logiciel associé au lecteur de microplaques, nonder le menu &quot;Fichier&quot;, cliquez sur &quot;Nouvelle tâche&quot;. Mettez en surbrillance &quot;Protocoles&quot; et cliquez sur &quot;Créer nouveau&quot;. Dans la fenêtre suivante, le cercle à côté de &quot;protocole standard&quot; doit être sélectionné. Cliquez sur &quot;OK&quot;. Double-cliquez sur «Procédure» sur le côté gauche de l&#39;écran. <ol><li> Distribuer 10 ul de substrat de la luciférase de luciole à tous les puits à l&#39;aide de distributeur 1. Dans le menu &quot;Actions&quot;, cliquez sur &quot;Dispense&quot;. Dans la fenêtre «Distribuer étape&quot;, set: «Distributeur» à 1, &quot;Amorçage&quot; à aucun, &quot;Volume Dispense&quot; à 10 pi et &quot;Rate&quot; à 225 pi / sec. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Agiter la plaque pendant 30 sec. Dans le menu &quot;Actions&quot;, cliquez sur &quot;Shake&quot;. Dans la fenêtre «Secouez étape&quot;, réglez &quot;Intensity&quot; à moyen et «Durée» à 00h30 MM: SS. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Lire la luminescence de tous les puits de 0,5 sec par puits. Dans le menu &quot;Actions&quot;, cliquez sur &quot;Lire&quot;;. Dans la fenêtre &quot;Lire étape&quot;, set: «Méthode de détection&quot; à luminescence, &quot;Lire Type&quot; Endpoint &quot;temps d&#39;intégration&quot; à 00:00:50 MM: SS: ss, &quot;jeux de filtres&quot; à une &quot;émission&quot; Hole, &quot;Optique Position&quot; de la page &quot;Gain&quot; à 135, et &quot;Lire Hauteur&quot; à 1,00 mm. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Distribuer 10 ul de substrat de la luciférase Renilla à tous les puits à l&#39;aide de distributeur 2. Définissez les conditions à l&#39;étape 5.6.1, sauf ensemble &quot;distributeur&quot; à 2. </li><li> Agiter la plaque pendant 30 secondes. Fixer les conditions que l&#39;étape 5.6.2. </li><li> Lire la luminescence de tous les puits de 0,5 sec par puits. Fixer les conditions que l&#39;étape 5.6.3. </li></ol></li><li> Retirez le couvercle de la plaque à 96 puits et placer la plaque dans le lecteur de microplaques. Démarrez le programme mis en place à l&#39;étape 5.5 pour lire plaque luminescence. </li><li> Nettoyez les pompes de distribution de réactifs. De l&#39;icône du système sous l&#39;onglet «distributeur»: <ol><li> Purger 1000 pi de firefly substrat de la luciférase de la luciole luciférase distributeur dans un tube de récupération. REMARQUE: la luciférase de luciole peut être stocké à -80 ° C, et réutilisés. </li><li> Premier distributeur de chaque 1000 pi d&#39;eau distillée, puis de 1000 pi de 70% d&#39;éthanol, et enfin 1500 pi de l&#39;air (supprimer les distributeurs de liquide). REMARQUE: L&#39;eau élimine les substrats de luciférase des pompes de réactifs, désinfecte d&#39;éthanol et sèche à l&#39;air tout éthanol résiduel. </li></ol></li></ol> 6. Analyse des données <ol><li> Data Export <ol><li> Dans le logiciel de lecteur de microplaques, double-cliquez sur &quot;Rapport / Export constructeurs» sur le côté gauche de l&#39;écran. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Nouveau Exporter vers Excel&quot; et cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Sélectionnez Export1 et cliquez sur &quot;Modifier&quot;. <ol><li> Sous la rubrique «Contenu» cochez la case «Description du système&quot;, &quot;procédure&quot;, &quot;Plate Description», et «disposition de la plaque Matrix&quot;. Inclure un &quot;données brutes&quot;e &quot;Calculé données&quot;. </li><li> Sous &quot;Workflow&quot;, cochez la case &quot;Exécuter automatiquement à l&#39;issue de la procédure&quot;. Sous le mode d&#39;exportation, consultez «Toutes les plaques dans le même classeur» et «En tant que nouvelle feuille de calcul&quot;. </li><li> Sous &quot;Fichier&quot; puis choisissez le format du nom de fichier et l&#39;emplacement du fichier, et cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Fermez la fenêtre &quot;Rapport / constructeurs exportation&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Pour obtenir des valeurs de luciférase normalisées, diviser la luciférase de luciole lecture de luminescence pour chaque puits (étape 5.6.3) par la lecture de luminescence Renilla pour chaque puits (étape 5.6.6). </li></ol>

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K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metric+for+odorant+comparison.">A metric for odorant comparison.</a> Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).</li><li>Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors:+From+basic+science+to+applications+in+flavors+and+fragrances.">Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances.</a> Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).</li><li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system.">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li><li>Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+map+in+the+mouse+olfactory+bulb:+in+vivo+sensitivity+and+specificity+of+receptor-defined+glomeruli.">Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli.</a> Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).</li><li>Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li><li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons.">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li><li>McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+odorant+receptor+OR2J3+is+associated+with+the+ability+to+detect+the+&amp;#34;grassy&amp;#34;+smelling+odor,+cis-3-hexen-1-ol.">Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the &amp;#34;grassy&amp;#34; smelling odor, cis-3-hexen-1-ol.</a> Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).</li><li>Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evolution+of+mammalian+odorant+receptors.">Functional evolution of mammalian odorant receptors.</a> PLoS genetics. 8 (7), (2012).</li><li>Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates.">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li><li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor.">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li><li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants.">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li><li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+ROC+analysis.">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li><li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors.">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li><li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells.">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Identité odorant est codé par des motifs d&#39;activation des récepteurs olfactifs, mais les modèles d&#39;activation des récepteurs, y compris les récepteurs qui sont activées et à quel degré, sont connus pour moins de 6% des récepteurs olfactifs humains 1-11. Les efforts visant à caractériser les récepteurs olfactifs ont été limités par leurs méthodes ou de l&#39;applicabilité de main-d&#39;œuvre à un sous-ensemble de la 17,23,24,33,34 de famille de récepteur olfactif. Le sys...

Le système olfactif de mammifère a la capacité de répondre à un grand nombre de stimuli odorants, permettant la détection et la discrimination des milliers de substances odorantes. Les récepteurs olfactifs (RUP) sont les capteurs moléculaires exprimés par les neurones sensoriels olfactifs dans l&#39;épithélium olfactif 12. La reconnaissance de l&#39;odeur de mammifère se produit par l&#39;activation différentielle des RUP par odorants, et la famille ou le gène est vaste, avec environ 1000 murin et 400 récepteurs humains 12-16. Analyses fonctionnelles antérieures de RUP dans les neurones olfactifs et dans les cellules hétérologues ont montré que différentes substances odorantes sont reconnus par unique, mais qui se chevauchent ensembles de RUP 10,17-20. Ligands correspondants à RUP est essentiel pour comprendre le code olfactif et essentiel pour construire des modèles viables de l&#39;olfaction. En raison de la difficulté à exprimer des RUP dans des systèmes hétérologues ainsi que le grand nombre des deux substances odorantes et les RUP, ces données ont été largement absent de la fIELD; en effet, moins de 6% des RUP humains ont un ligand publié 1-11. Ce protocole décrit l&#39;utilisation d&#39;un dosage de la luciférase pour caractériser les interactions odorantes / OU. Ce test permet la caractérisation à haut débit de RUP, une tâche qui est essentielle pour comprendre odorant / OU interactions ainsi que l&#39;élaboration d&#39;un modèle de codage des odeurs. Études à haut débit de RUP sont confrontées à trois défis majeurs. Tout d&#39;abord, RUP exprimés dans des cellules hétérologues ont été retenues dans le RE et ensuite dégradées dans le protéasome 21,22, ce qui empêche les RUP d&#39;interagir avec des substances odorantes dans le système de dosage de 23 à 25. Ce problème a été résolu par la découverte de protéines accessoires qui facilitent l&#39;expression stable à la surface cellulaire d&#39;un large éventail de RUP 19,26,27. Récepteur-transporteur protéines 1 et 2 (RTP1 et 2) promouvoir ou expression à la surface cellulaire et l&#39;activation en réponse à la stimulation odorante 19. Sur la base de ce travail, les cellules étaient HEK293Tmodifiée pour exprimer de manière stable à long RTP1 (RTP1L) et RTP2, améliorant l&#39;expression du récepteur de protéine 1, et G αolf, résultant dans la lignée cellulaire Hana3A 19,27. En outre, le récepteur de l&#39;acétylcholine muscarinique de type 3 (M3-R) interagit avec RUP à la surface des cellules et augmente en réponse à l&#39;activation 26 des agents odorants. La co-transfection d&#39;un OU avec RTP1S et M3-R en Hana3A cellules résulte de l&#39;expression robuste, cohérente et fonctionnelle d&#39;un large éventail de RUP à la surface de la cellule 27. Deuxièmement, mammifères ou répertoires sont assez grandes. Chez les êtres humains, par exemple, le répertoire OR est un ordre de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs gustatifs, et deux ordres de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs visuelle. Bien que le clonage d&#39;un simple OU est un protocole relativement simple, important effort initial est nécessaire pour générer une bibliothèque complète. Troisièmement, même si nous savons que dans la vision, la longueur d&#39;onde se traduit par la couleur etla fréquence de l&#39;audition se traduit pas, l&#39;organisation des odeurs est mal comprise, ce qui rend difficile pour les chercheurs d&#39;interpoler à partir d&#39;un échantillon représentatif de substances odorantes. Bien que certains progrès ont été réalisés sur ce front 10,28, la carte du paysage olfactif reste incomplète. Dépistage des dizaines de milliers de molécules contre des centaines de RUP est une tâche ardue; criblages à haut débit dans ce domaine nécessitent des campagnes soigneusement définis. Les principaux défis à relever sont ceux de la logistique et des coûts plutôt que sur les problèmes inhérents à la technique. Bien que le dépistage hétérologue n&#39;a pas été largement utilisé pour identifier des ligands par des groupes universitaires, une société privée a utilisé la même technique pour identifier des ligands pour 100 RUP humaines 29. Malheureusement, ces données restent propriétaires. Le dosage de la luciférase à haut débit décrit ici présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives utilisées pour évaluer ou d&#39;activation. Bien que la responsabilitésession de neurones sensoriels olfactifs indigènes ont été mesurées à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie et d&#39;imagerie calcique, ces techniques ont des difficultés à taquiner à part qui OU conduit à la réponse d&#39;un neurone en raison du chevauchement dans les propriétés de réponse des neurones olfactifs. Bien que dans un cognement-GFP-étiqueté du récepteur de type 30,31, délivrant par l&#39;intermédiaire de récepteurs spécifiques de l&#39;adénovirus murins neurones olfactifs 32,33, ou d&#39;effectuer une RT-PCR après enregistrements 17,24,33 peuvent lier des enregistrements de types de récepteurs individuels, ces méthodes sont faible débit et ne convient pas pour les écrans de grande envergure. Systèmes de contrôle hétérologues sont plus évolutive, et deux formes principales se trouvent dans la littérature: les journalistes de la voie de l&#39;AMPc et l&#39;inositol triphosphate (IP3) journalistes de la voie. Lors de la stimulation de l&#39;odeur, RUP activent une cascade de signalisation αolf G de transduction qui conduit à la production d&#39;AMP cyclique (AMPc) 12. Par co-transfection d&#39;un gène rapporteur de luciférase de luciole sous le contrôle d&#39;acÉlément de réponse à l&#39;AMP (CRE), la production de la luciférase peut être mesurée en fonction de la réponse de l&#39;odeur, ce qui permet la quantification de l&#39;activation OU. Ou l&#39;activation peut également être lié à la voie IP3 par la co-expression des protéines G telles que G α15/16 ou un G α15-olf chimère 24,25,34. Nous avons choisi le test présenté ici repose sur trois facteurs: (1) la co-expression de RTP1 avec récepteurs olfactifs Rho-marqués améliore l&#39;expression des récepteurs olfactifs à la surface des cellules 19,27; (2) l&#39;utilisation d&#39;un gène rapporteur AMPc-sensible permet la mesure de OU activation par la voie de second messager canonique; et (3) le test est bien adaptée aux écrans à haut débit. Ce dosage de la luciférase à haut débit est applicable à une variété d&#39;études de grande valeur dans le domaine de l&#39;olfaction. Premièrement, un grand nombre de RUP peut être criblée contre une seule substance odorante en vue de déterminer le motif de l&#39;activation du récepteur pendant une spodorant ecific. Ce type d&#39;étude a identifié OR7D4 comme le OU chargé de répondre à l&#39;androsténone odorant stéroïde 8. Inversement, un ou peut être projeté contre un panneau de substances odorantes afin de déterminer le profil de la réponse du récepteur 10. Lorsque candidat olfactif odorant / OU paires sont identifiés par ces écrans, l&#39;interaction peut être confirmé par la réalisation d&#39;une expérience de dose-réponse examiner la réponse de la salle d&#39;opération à des concentrations croissantes de substance odorante. courbes dose-réponse peuvent également évaluer la variation génétique dans une OU affecte en réponse odorant vitro 8,9,11,35, et ces études peuvent être étendues à interspécifique OU variation, permettant à l&#39;examen de l&#39;évolution des récepteurs à travers les espèces et les mutations causales dans l&#39;évolution 36,37, Enfin, ce dosage peut être utilisé pour cribler des antagonistes d&#39;odeurs qui sont capables d&#39;antagoniser ou une réponse à une substance odorante particulier pour une paire odorant / récepteur connue 38,39. En résumé, cette hauteDosage de la luciférase-débit est applicable à une série d&#39;études qui aideront à caractériser ou des motifs d&#39;activation et de fournir une meilleure compréhension du codage des odeurs dans le système olfactif.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="685">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Hana3A cells</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">RTP1S-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">M3-R-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pCRE-luc</td>
			<td style="width:135px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">219076</td>
			<td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pSV40-RL</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2231</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Media, Eagle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4655</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp;region=US">MEM</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-16000044">FBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td><a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product">Trypsin</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">CD293</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11913-019</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019?ICID=search-11913019">CD293</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">96 well PDL white/clear plate</td>
			<td style="width:135px;">BD BioCoat</td>
			<td style="width:119px;">356693</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019?ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2980</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&amp;__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&amp;__utmx=-&amp;__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy S2&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SLAD</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Gen5</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIOSTACK</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">BIOSTACK2WR</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Multiflo</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">MFP</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4414</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips ViaFlo96</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips 384 XYZ</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6403</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384ViaFlo</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td>6030</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740797.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp;region=US">DMSO</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-CN100-0010</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity

Odorants créer des motifs uniques et se chevauchant de l&#39;activation du récepteur olfactif, ce qui permet une famille d&#39;environ 1000 et 400 murin récepteurs humains de reconnaître des milliers de substances odorantes. Ligands odorants ont été publiés pour moins de 6% des récepteurs humains 1-11. Ce manque de données est dû en partie à la difficulté à exprimer fonctionnellement ces récepteurs dans des systèmes hétérologues. Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer la majorité de la famille des récepteurs olfactifs dans des cellules Hana3A, suivi d&#39;une évaluation à haut débit de l&#39;activation du récepteur en utilisant un test olfactif rapporteur de la luciférase. Ce dosage peut être utilisé pour (1) des panneaux d&#39;écran de substances odorantes contre les panneaux de récepteurs olfactifs; (2) confirmer interaction odorant / récepteur via des courbes dose-réponse; et (3) comparer les niveaux d&#39;activation du récepteur entre les variants du récepteur. Dans nos données d&#39;exemple, 328 récepteurs olfactifs ont été projetés contre 26 odorants. Paires odorant / récepteurs avec des scores variant de réponse étaient de sélectionted et testé en réponse à la dose. Ces données indiquent que l&#39;écran est une méthode efficace pour enrichir en paires odorant / récepteurs qui vont passer d&#39;une expérience de dose-réponse, à savoir les récepteurs qui ont une réponse de bonne foi à une substance odorante. Par conséquent, ce dosage de la luciférase à haut débit est une méthode efficace pour caractériser les récepteurs-une étape essentielle olfactif vers un modèle de codage d&#39;odeur dans le système olfactif de mammifère.

Un écran primaire testé 328 RUP contre 26 odeurs à une concentration de 100 uM. Cette concentration d&#39;odeur a été démontrée pour activer efficacement une grande proportion des RUP avec des ligands connus 10. Tout d&#39;abord, l&#39;activité de la luciférase normalisée a été calculée en divisant la lecture de la luciférase de luciole par la luciférase de Renilla lecture. Ensuite, les valeurs baselined ont été calculées en soustrayant les lectures de la luciférase normalisée pou...

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High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Modèles d&#39;activation des récepteurs olfactifs codent l&#39;identité de l&#39;odeur, mais le manque de données publiées identification des ligands odorants pour les récepteurs olfactifs de mammifères entrave le développement d&#39;un modèle complet de codage de l&#39;odeur. Ce protocole décrit un procédé pour faciliter l&#39;identification à haut débit de ligands de récepteurs olfactifs et la quantification de l&#39;activation du récepteur.

Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

high-throughput-analysis-mammalian-olfactory-receptors-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.3K vues.  Monell Chemical Senses Center.  Modèles d'activation des récepteurs olfactifs codent l'identité de l'odeur, mais le manque de données publiées identification des ligands odorants pour les récepteurs olfactifs de mammifères entrave le développement d'un modèle complet de codage de l'odeur. Ce protocole décrit un procédé pour faciliter l'identification à haut débit de ligands de récepteurs olfactifs et la quantification de l'activation du récepteur. 

Vidéo: High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d&#39;aspiration

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM Imagerie et FIMtrack: Deux nouveaux outils permettant à haut débit et de l&#39;analyse coûts de locomotion efficace

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to perform receptor autoradiographic mapping.
Tissue specimens are harvested and stored at -80 &#176;C. A cryostat is used to coronally section the tissue (brain) and thaw-mount the sections onto charged slides. The slide-mounted tissue sections are incubated in 125I-SI-Ang II to radiolabel Ang II receptors. Adjacent slides are separated into two sets: &#39;non-specific binding&#39; (NSP) in the presence of a receptor saturating concentration of non-radiolabeled Ang II, or an AT1 Ang II receptor subtype (AT1R) selective Ang II receptor antagonist, and &#39;total binding&#39; with no AT1R antagonist. A saturating concentration of AT2 Ang II receptor subtype (AT2R) antagonist (PD123319, 10 &#181;M) is also present in the incubation buffer to limit 125I-SI-Ang II binding to the AT1R subtype. During a 30 min pre-incubation at ~22 &#176;C, NSP slides are exposed to 10 &#181;M PD123319 and losartan, while &#39;total binding&#39; slides are exposed to 10 &#181;M PD123319. Slides are then incubated with 125I-SI-Ang II in the presence of PD123319 for &#39;total binding&#39;, and PD123319 and losartan for NSP in assay buffer, followed by several &#39;washes&#39; in buffer, and water to remove salt and non-specifically bound radioligand. The slides are dried using blow-dryers, then exposed to autoradiography film using a specialized film and cassette. The film is developed and the images are scanned into a computer for visual and quantitative densitometry using a proprietary imaging system and a spreadsheet. An additional set of slides are thionin-stained for histological comparisons.
The advantage of using receptor autoradiography is the ability to visualize Ang II receptors in situ, within a section of a tissue specimen, and anatomically identify the region of the tissue by comparing it to an adjacent histological reference section.

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Receptor Protocole autoradiographie pour la visualisation Localisée de l&#39;angiotensine II Receptors

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.