Hello.Today nous allons vous montrer un protocole qui protoplaste des millions de cellules mésophylles de maïs et les transforme avec une grande efficacité. Les principales étapes du protocole consistent d’abord à digérer et à éliminer la paroi cellulaire végétale, à libérer les protoplastes, puis à transformer le protoplaste à l’aide de PEG. La grande différence entre ce protocole et d’autres est l’ampleur de la transformation.
La plupart des protocoles aboutissent avec entre 1 000 et 10 000 protoplastes transformés. Cependant, notre protocole donne des millions de protoplastes de maïs transformés. Ici, nous avons des plants de maïs cultivés dans l’obscurité pendant neuf à 11 jours après la germination.
Coupez les semis juste au-dessus du niveau du sol et placez-les dans l’eau. Gardez les plantes dans l’obscurité lorsqu’elles ne sont pas utilisées. Sélectionnez les deuxième et troisième feuilles de chaque plantule, en prenant soin d’exclure les feuilles avec des zones brunes ou endommagées.
Sélectionnez 12 à 16 feuilles et coupez un centimètre des pointes. Ensuite, coupez une section de 10 centimètres de chaque feuille. Empilez les sections de feuilles les unes sur les autres avec les extrémités basales ensemble.
Serrez le faisceau ensemble à l’extrémité basale à l’aide d’un clip de liant. Placez le paquet de feuilles sur un morceau de papier blanc. Couper des tranches de feuilles de 0,5 à un millimètre de large.
Il est important de couper de fines tranches cohérentes. Après avoir coupé une partie du faisceau de feuilles, transférer les tranches dans la solution enzymatique. Ne laissez pas le matériau sécher.
Remuez doucement la solution enzymatique pour mouiller le matériau. Placez du papier d’aluminium sur le bécher pour bloquer la lumière. Répétez ce processus jusqu’à ce que tout le paquet soit coupé près du clip de liant.
Après la coupe, la solution devrait ressembler à ceci. Transférer le bécher de solution enzymatique dans un clocher. Le vide s’infiltre pendant trois minutes à température ambiante.
Incuber sur un shaker de table à 40 RPM à température ambiante pendant deux heures et demie. Après l’incubation, donnez un tourbillon à la solution. Il devrait avoir l’air laiteux, indiquant une digestion réussie.
Incuber sur le shaker de table à 80 RPM à température ambiante pendant 10 minutes de plus. Placez le bécher avec la solution enzymatique sur la glace. Arrêtez la digestion en ajoutant un volume de MMG glacé.
Filtrer à travers une crépine cellulaire de 40 microns dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Diviser la solution en aliquotes d’au plus 10 millilitres chacune. Verser dans des tubes de verre à fond rond réfrigérés.
Centrifuger les tubes à 100 G pendant quatre minutes. Retirez le surnageant en veillant à ne pas déranger la pastille. Resuspendez, puis regroupez les échantillons pour les lavages ultérieurs.
Lavez les protoplastes deux fois avec cinq millilitres de MMG. Faites tourner vers le bas à chaque fois à 100 G pendant trois minutes. Le granulé doit être d’une belle couleur vert jaune vif.
Vous pourrez remettre en suspension la pastille en faisant tourner doucement le tube. Remettez en suspension dans un millilitre de MMG, et diluez une petite partie aliquote 10 à 20x pour compter. Il est important de bien remettre en suspension avant l’aliqouting, car les protoplastes se déposeront rapidement.
Chargez les protoplastes dilués dans l’hémocytomètre. Comptez les protoplastes au microscope optique. Une bonne préparation n’aura pas beaucoup de débris en excès flottant après le lavage.
Les bons protoplastes sont circulaires avec des plastes visibles. Utilisez le nombre de cellules pour calculer le nombre total. Cette préparation a abouti à un peu plus de 10 millions de protoplastes.
Nous recommandons de vérifier la viabilité à l’aide d’un colorant diacétate de fluorescéine. Des isolations réussies de protoplastes donnent une viabilité comprise entre 70 et 90%Mélangez les protoplastes avec votre plasmide d’intérêt. Cet exemple utilise 1 million de protoplastes et 15 microgrammes d’ADN.
Incuber sur la glace pendant 30 minutes. Remettez en suspension en tapotant le côté du tube. Ajouter une solution de PEG pour atteindre une concentration finale de 12% de PEG.
Mélanger doucement en retournant plusieurs fois. Les protoplastes et la solution de PEG sont fragiles, alors ne secouez pas le tube. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes.
Diluer avec cinq volumes de solution d’incubation et mélanger doucement par inversion. Centrifuger les tubes à 100 G pendant quatre minutes. Laver une fois avec un tampon d’incubation d’un millilitre.
Veillez à ne pas déranger le granulé. Faire tourner vers le bas à 100 G pendant trois minutes. Resuspendre dans le tampon d’incubation à une concentration de 500 à 1000 cellules par microlitre.
Incuber dans l’obscurité pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, faites tourner à 100 G pendant quatre minutes. Laver deux fois avec une solution d’incubation réfrigérée.
Tourner vers le bas à chaque fois pendant trois minutes à 100 G à température ambiante. Resuspendez, puis chargez une petite partie aliquote sur l’hémocytomètre pour le contrôle final. Tout d’abord, comptez le nombre total de protoplastes sous fond clair.
Maintenant, observez la fraction de protoplastes qui fluorescent sous UV pour vérifier la transfection. Les protoplastes expriment notre journaliste GFP. Maintenant, obtenons quelques mesures sur l’efficacité de la transfection.
Dans cette préparation, nous avons obtenu 10 millions de protoplastes au total, dont nous avons transfecté 1 million. Le lendemain, nous en avons récupéré 335 000. Parmi ceux-ci, nous avons eu un taux de transformation de 30,3%, ce qui nous laisse avec notre total d’environ 100 000 protoplastes exprimant la GFP.
L’efficacité de la transfection peut varier. Comme vous pouvez le voir dans le graphique, nous constatons régulièrement des gains d’efficacité compris entre 20 et 50% parmi les préparations répétées. Ce protocole permet la collecte et la transformation de millions de protoplastes mésophylles de maïs.
L’une des meilleures parties du protocole est sa capacité à évoluer. En augmentant la quantité de volume ainsi que le nombre de protoplastes utilisés dans la transformation, vous pouvez augmenter votre transformation de plus d’un ordre de grandeur par rapport à ce que nous avons montré aujourd’hui. À ce jour, notre plus grande expérience à tube unique a commencé avec 20 millions de protoplastes et 200 microgrammes d’ADN, et s’est terminée avec 3,1 millions de protoplastes transformés le lendemain.
Ce protocole à haut débit est particulièrement utile lorsque vous devez tester de nombreuses constructions plasmidiques différentes, mais les collaborateurs ont utilisé ce protocole à des fins qui ne nécessitent pas la possibilité de mettre à l’échelle, telles que la conception de circuits de gènes synthétiques et de maïs. Merci d’avoir regardé notre vidéo. Nous espérons que cela vous a aidé.
