We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

1 Manuel abstrait Modèle génération Remarque: Les détails de la méthodologie décrits ci-dessous sont spécifiques à Chimera, mais d&#39;autres logiciels peuvent être utilisés à la place. Utilisez cette méthode lorsque le seul objectif est de créer un modèle géométrique (par exemple, une balle et bâton modèle) afin d&#39;effectuer des mesures géométriques, plutôt que d&#39;afficher la forme de volume des objets. <ol><li> Importez le volume de données dans un programme approprié pour le manuel génération de modèle abstrait. <ol><li> Sélectionnez Fichier&gt; Ouvrir la carte à tirer vers le haut la boîte de dialogue Ouvrir un fichier. Accédez à l&#39;emplacement du fichier de la carte désirée. </li><li> Tirez le Volume Viewer (Outils&gt; Données de volume&gt; Volume Viewer) et sélectionnez Options&gt; Style d&#39;affichage pour afficher les données avec différents styles de rendu. </li><li> Réglez le seuil pour l&#39;affichage en faisant glisser la barre verticale sur l&#39;histogramme dans le Volume Viewerfenêtre. </li></ol></li><li> Naviguez à travers le volume 3D (par exemple, tranche par tranche) pour sélectionner une zone d&#39;intérêt pour la segmentation et recadrer un sous-volume plus petit si nécessaire. <ol><li> Dans la boîte de dialogue Volume Viewer, cliquez sur Axe, puis sélectionnez X, Y, ou Z. </li><li> Dans la boîte de dialogue Volume Viewer, sélectionnez Options&gt; Avions. Cliquez sur un de fixer Profondeur pour afficher le plan correspondant au numéro dans la case de gauche, et cliquez sur Tous pour afficher tous les plans. </li><li> Dans la boîte de dialogue Volume Viewer, sélectionnez Options&gt; sélection de la sous-région. <ol><li> Cliquez et faites glisser pour créer une boîte rectangulaire autour de la région d&#39;intérêt. </li></ol></li></ol></li><li> Placer des marqueurs le long de la caractéristique d&#39;intérêt et les connecter avec des linkers le cas échéant (souvent faites automatiquement par le programme) jusqu&#39;à ce que le modèle est complet. <ol><li> Dans la barre de menu Volume Viewer, sélectionnez Outils&gt;dialogue Tracer Volume pour ouvrir la boîte de dialogue Volume Tracer. Dans la boîte de dialogue Tracer de volume, sélectionnez Fichier&gt; Nouveau marqueur Set. </li><li> Dans la boîte de dialogue Tracer Volume, vérifiez Souris&gt; La place des marqueurs sur la qualité, la Place des marqueurs sur des plans de données, déplacer et redimensionner les marqueurs, lien nouveau marqueur marqueur sélectionné, et Link marqueurs consécutivement sélectionné. </li><li> Cliquez sur l&#39;échantillon Couleur de marqueur, puis sélectionnez une couleur. Répétez cette étape pour la couleur du lien. </li><li> Entrez rayons pour les éléments de construction de modèle marqueurs et de liaison. </li><li> Dans la fenêtre de trace de volume, sélectionnez place des marqueurs en utilisant le bouton [droite] de la souris, et insérer les rayons des marqueurs et des liens. </li><li> Faites un clic droit sur les données de volume pour commencer fixant marqueurs. Marqueurs seront automatiquement connectés. </li><li> Dans la boîte de dialogue Tracer Volume, sélectionnez Fichier&gt; Enregistrer ensemble de marqueurs en cours, puis Fichier&gt; Fermer marqueur ensemble. </li></ol></li&gt; <li> Ouvrez un nouveau jeu de marqueurs (étape 1.3.1) pour commencer à construire un modèle dans une deuxième caractéristique d&#39;intérêt souhaité. Utiliser des couleurs entre les ensembles de marqueurs contraste pour souligner les différences dans les caractéristiques. </li></ol> 2 Manuel traçage des éléments d&#39;intérêt Remarque: Les détails de la méthodologie décrits ci-dessous sont spécifiques à Amira, mais d&#39;autres logiciels peuvent être utilisés à la place. Utilisez cette méthode lorsque la densité de population est relativement faible et lorsque la précision de l&#39;extraction de caractéristiques est primordiale, comme le traçage manuel est une approche de longue haleine. <ol><li> données sur le volume des importations dans un programme de manuels options de trace. Logiciel avec cette capacité offrent généralement au moins un outil de pinceau de base. <ol><li> Pour les grands volumes ou des tomographies (par exemple, 16 bits 2048 x 2048 ou plus .rec ou .mrc tomographies généré dans MID): Sélectionnez Open Data&gt; clic droit sur ​​filename.rec&gt; Format ...&gt; Sélectionner Raw comme LargeDiskData </i&gt;&gt; OK&gt; Charger. Sélectionnez Raw appropriée de paramètres de données à partir des informations d&#39;en-tête&gt; OK. Basculer et Enregistrer sous un nouveau <a href="http://filename.am/">filename.am</a> fichier pour une utilisation dans les étapes suivantes. </li><li> Pour les fichiers plus petits d&#39;image 3D de la pile (par exemple, .tif 3D ou .mrc ou .rec): Open Data&gt; Sélectionner filename.tif ou filename.mrc. Basculer et Clic droit&gt; Enregistrer sous <a href="http://filename.am/">filename.am</a> . Si une erreur est générée ou le programme ne répond pas, le fichier peut être trop grande et peut être ouvert en suivant l&#39;étape 2.1.1. </li></ol></li><li> Naviguer à travers les tranches de sélectionner un sous-volume 3D pour la segmentation, et ensuite recadrer à ce domaine d&#39;intérêt. <ol><li> Dans la fenêtre 3D Viewer, sélectionnez Orthoslice d&#39;ouvrir le fichier d&#39;image. Utilisez le curseur en bas pour naviguer dans les tranches. </li><li> Pour recadrer données plus grands ouverts que LargeDiskData, bascule nom de fichier dans la fenêtre Piscine&gt; clic droit&gt; LatticeAccess. Enter la taille de la boîte désirée&gt; Appliquer. Enregistrer le nouveau fichier. </li></ol></li><li> Créer un fichier de segmentation. <ol><li> Déplacez le fichier dans la fenêtre Bibliothèque&gt; Clic droit&gt; Étiquetage&gt; LabelField. Un nouveau fichier sera créé et chargé automatiquement dans l&#39;onglet Segmentation éditeur. </li></ol></li><li> Tracer le cadre de la première caractéristique d&#39;intérêt, puis remplissez la trace à la main ou à l&#39;aide d&#39;une commande spécifique au logiciel utilisé. Suivez la fonction d&#39;intérêt par toutes les tranches et répéter le traçage segmentation manuelle. Utilisez les commandes suivantes lors de l&#39;utilisation Amira: <ol><li> Pour utiliser l&#39;outil Pinceau, modifier la taille du pinceau comme vous le souhaitez, puis utilisez le pointeur de la souris pour tracer la frontière de la fonction d&#39;intérêt. </li><li> Remplissez la zone tracée au raccourci &quot;f&quot;. Ajouter la sélection en cliquant sur le bouton avec le symbole plus, ou le raccourci &quot;a&quot;. Si nécessaire, appuyez sur &quot;u&quot; pour annuler, et &quot;s&quot; de soustraire ou effacer. </li></ol&gt; </li><li> Générer un rendu de surface pour la visualisation et qualitative de base ou l&#39;analyse quantitative par logiciel notice instruction. <ol><li> Dans l&#39;onglet de la piscine de l&#39;objet, déplacez le fichier-labels.am dans la fenêtre Bibliothèque&gt; clic droit&gt; SurfaceGen. </li><li> Sélectionnez les propriétés de surface souhaitées&gt; Appliquer. Une nouvelle filename.surf de fichier sera créé dans le Pool. </li><li> Pour visualiser le volume segmenté, bascule filename.surf dans la fenêtre Piscine&gt; clic droit&gt; SurfaceView. </li><li> Utilisez les outils dans la fenêtre 3DViewer à déplacer, faire pivoter, agrandir et le volume 3D. </li></ol></li><li> Extraire les densités exactes et déterminer des mesures comme le volume ou la superficie. Exportation vers d&#39;autres programmes pour l&#39;affichage plus avancé, l&#39;analyse et la simulation. <ol><li> Dans la fenêtre 3DViewer, cliquez sur l&#39;outil de mesure&gt; Sélectionnez l&#39;option appropriée (longueur 2D et 2D angle pour les mesures sur un plan 2D unique, longueur 3D et l&#39;angle 3Dpour les mesures sur un volume 3D). </li><li> Cliquez sur la surface de maille pour mesurer la longueur désirée, la distance et les angles. Les valeurs seront listés dans la fenêtre Propriétés. </li></ol></li></ol> 3 Segmentation base de la densité-automatique Remarque: Les détails de la méthodologie décrits ci-dessous sont spécifiques à Amira, mais d&#39;autres logiciels peuvent être utilisés à la place. <ol><li> Utilisez cette méthode sur des ensembles de données avec n&#39;importe quelle variété de contraste, netteté, ou cohue de retirer les densités d&#39;intérêt. </li><li> données sur le volume des importations dans un programme équipé d&#39;un seuil, baguette magique, ou d&#39;autres outils à base de densité pour la segmentation automatique. Suivez les étapes décrites dans 2.1-2.1.2 dans les directions pour le traçage manuel. </li><li> Naviguez à travers les tranches et sélectionner la zone de segmentation. Si nécessaire, recadrer un sous-volume 3D plus petit pour la segmentation. Suivez les étapes décrites dans 2.2-2.2.2 dans les directions pour le traçage manuel. </li><li> Sélectionnez la densité deune fonction d&#39;intérêt, généralement en cliquant ou en plaçant un point d&#39;interrogation ou point d&#39;ancrage sur la fonction. Si on le laisse dans le logiciel, entrez une plage de numéros englobant l&#39;intensité de pixel de la fonction et régler cette tolérance comme vous le souhaitez. Densités appartenant à la fonction seront ramassés conformément à l&#39;intensité de pixel ou de la tolérance de la valeur de l&#39;ancre. Utilisez les commandes suivantes lors de l&#39;utilisation Amira. <ol><li> Utilisez la baguette magique pour les fonctions avec des marges distinctes. <ol><li> Cliquez sur la zone d&#39;intérêt, puis d&#39;ajuster les curseurs dans l&#39;affichage et masquage de capturer gamme correcte de valeurs de sorte que la fonctionnalité est complètement mis en évidence. Ajouter la sélection de raccourci &quot;a&quot;. </li></ol></li><li> Utilisez l&#39;outil de seuil pour les fonctions sans marges bien distinctes. </li><li> Sélectionnez l&#39;icône du Seuil. Réglez la glissière pour régler la densité dans la plage souhaitable de sorte que seules les caractéristiques d&#39;intérêt sont masqués. Cliquez sur le bouton Sélectionner, puis ajouter la sélection avec raccourci220; une &quot;. </li><li> Pour tout le segment volume, sélectionnez Tous les tranches avant d&#39;ajouter la sélection. </li><li> Pour supprimer le bruit, sélectionnez Segmentation&gt; Supprimer îles et / ou segmentation&gt; étiquettes lisses. </li></ol></li><li> Génération d&#39;une surface de visualisation et l&#39;analyse qualitative de la manière décrite dans la section de traçage manuel 2.6-2.6.2. Si vous le souhaitez, l&#39;exportation vers d&#39;autres programmes pour l&#39;affichage 3D adéquate, l&#39;analyse quantitative et simulations. </li></ol> 4. personnalisé sur mesure automatisée de segmentation Remarque: Utilisez cette méthode pour créer des scripts personnalisés pour la segmentation automatique, ce qui requiert de l&#39;expérience de fond en informatique, mais permet la possibilité de créer un modèle de densité précis dans un grand volume. <ol><li> Outils (exemple spécifique de la segmentation de Shape-supervisé dans MATLAB 27) <ol><li> Prétraitement d&#39;images: Effectuer débruitage, suppression du fond et amélioration de l&#39;imageen utilisant le pipeline suivantes: <ol><li> Charger l&#39;image en utilisant la commande imread. <ol><li> Dans la ligne de commande, entrez: &gt;&gt; im = imread ($ image_path), où $ image_path est l&#39;emplacement de l&#39;image à analyser. </li></ol></li><li> De la boîte à outils de traitement d&#39;image, appelez Wiener filtre en utilisant un ratio estimé ou connu bruit-puissance de signal (NSR). </li><li> Sur l&#39;image précédemment traitée, appeler la fonction image d&#39;ouverture imopen pour estimer la couche de fond, puis affecter le résultat comme un masque différent. <ol><li> Dans la ligne de commande, entrez:. &gt;&gt; Background = imopen (im, strel ($ shape_string, $ taille)), dans cette méthode, $ shape_string est égal à &#39;dur&#39; la variable $ taille est donnée par l&#39;analyseur à savoir &gt;&gt; background = imopen (im, strel (&#39;disque&#39;, 15)). </li></ol></li><li> Soustraire l&#39;image filtrée avec le fond. <ol><li> Dans la ligne de commande, entrez: &gt;&gt; im2 = im -fond </li></ol></li><li> Selon la qualité des résultats, effectuez l&#39;image normalisation avec ou sans la méthode de Otsu adaptatif 28, qui peut être appelé en utilisant la fonction imadjust de l&#39;Image Processing Toolbox. <ol><li> Dans la ligne de commande, entrez: &gt;&gt; im3 = imadjust (IM2) </li></ol></li><li> Préparer les caractéristiques d&#39;intérêt pour la segmentation, ce qui limite les régions d&#39;intérêt par recadrage de l&#39;image normalisée. <ol><li> Utilisation de la commande imtool, explorer la région d&#39;intérêt qui doit être recadrée et fournir les coordonnées de la commande: &gt;&gt; im3_crop = imcrop (im3, [x1 y1 x2 y2]), où le vecteur [x1 y1 x2 y2] correspond à la région carrée à recadrer. </li></ol></li></ol></li><li> La reconnaissance de forme / classification de forme supervisée: Former l&#39;algorithme en fournissant des exemples spécifiques pour chaque catégorie d&#39;objets (traces linéaires dans une image 2D à travers les éléments d&#39;intérêt). <ol><li> Vérifiez que VLFEAT 29 API est correctement installé et visitez le site Web de VLFEAT une documentation plus approfondie. </li><li> Dans la ligne de commande, entrez: &gt;&gt; [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, K $, $ NLEAVES) où $ K est le nombre de cluster pour être utilisé ou le nombre de classes de l&#39;observateur veut organiser les données dans, et NLEAVES $ est le nombre désiré de bouquets de feuilles à savoir &gt;&gt; [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100) </li><li> Utiliser les fonctions segmentées manuellement l&#39;entrée pour VLFeat. NOTE: Cette librairie open source basé C-va appliquer des rustines de pixels, le regroupement des parcelles et le positionnement du centre de l&#39;amas en fonction du type de méthode choisie pour le mieux pour les jeux de données. Les options disponibles vont de regroupement k-moyenne basée sur texton à des approches 30, et la sortie est un tableau numérique qui décrit les caractéristiques souhaitées basées sur les exemples donnés. </li></ol></li></ol></li><li> Segmentation: Utilisez cette fully automatisé, bien que coûteuse en ressources informatiques, l&#39;approche à segments multiples classes d&#39;objets simultanément, qui seront écrits comme des cartes séparées pour plus d&#39;analyse et de visualisation. <ol><li> Chargez le tableau numérique généré précédemment (modèle). </li><li> Appelez la fonction machine à vecteurs de support (SVM) dans VLFeat, en utilisant le modèle et l&#39;image à segmenter comme une entrée. <ol><li> Dans la ligne de commande, entrez: &gt;&gt; [w, b] = vl_svmtrain (x, y, 0,1), où x est l&#39;original image recadrée im2_crop et y est l&#39;image objective, l&#39;image qui a été segmenté manuellement. Utilisez &gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG (I, LABELS) pour colorer les résultats en fonction des étiquettes générées par le regroupement. NOTE: Sur la base des caractéristiques du modèle, VLFeat classera l&#39;image sur le nombre de classes (éléments d&#39;intérêt) affectés depuis le début. Selon le degré de précision souhaitée, il est possible de combiner cette méthode avec d&#39;autres approches ou estimation Clustparamètres de veuf tels que les centres de la coque et munitions. La sortie de l&#39;algorithme de SVM est un modèle probabiliste et plusieurs masques binaires des classes désirées dans les nouveaux ensembles de données. </li></ol></li><li> Enregistrer les résultats en entrant la commande: &gt;&gt; imwrite (im, $ format, $ filename) où $ format est &quot;tiff&quot; et $ filename est le chemin du fichier de sortie. </li><li> Pour visualiser les images, entrez la commande: &gt;&gt; imshow (im). </li></ol></li></ol>

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	<li>Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+cryo-microscopy+as+a+powerful+structural+tool+in+molecular+medicine.">Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine.</a> J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).</li><li>Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+two-dimensional+crystallization+trials+of+small+membrane+proteins+for+structural+biology+studies+by+electron+crystallography.">Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).</li><li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions.">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).</li><li>Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HIV-1+capsid+assemblies+by+cryo-electron+microscopy+and+iterative+helical+real-space+reconstruction.">Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).</li><li>Chen, S., McDowall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryotomography+of+Bacterial+Cells.">Electron Cryotomography of Bacterial Cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).</li><li>Meyerson, J. R., White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+feature+extraction+and+visualization+of+tomographic+molecular+imaging.">Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging.</a> J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).</li><li>Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+3D+watershed+algorithm+incorporating+gradient+cues+and+object+models+for+automatic+segmentation+of+nuclei+in+confocal+image+stacks.">A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks.</a> Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).</li><li>Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+variant+of+the+watershed+transform+for+segmentation+of+electron+density+maps.">A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps.</a> Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).</li><li>Rigort, A., G&#252;nther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+segmentation+of+electron+tomograms+for+a+quantitative+description+of+actin+filament+networks.">Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks.</a> Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).</li><li>Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Statistical+Approaches+to+Level+Set+Segmentation.">A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation.</a> Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).</li><li>Lin, Z., Davis, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-based+human+detection+and+segmentation+via+hierarchical+part-template+matching.">Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+modeling+from+3D+EM+using+VolRover+2.0.">Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0.</a> Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+focused+ion+beam+milling+techniques+for+TEM+specimen+preparation.">A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation.</a> Micron. 30 (3), 197-204 (1999).</li><li>Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focussed+ion+beam+milling+and+scanning+electron+microscopy+of+brain+tissue.">Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).</li><li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+Ion+Beam+(FIB)+combined+with+SEM+and+TEM:+Advanced+analytical+tools+for+studies+of+chemical+composition,+microstructure+and+crystal+structure+in+geomaterials+on+a+nanometre+scale.">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Frangakis, A. S., Hegerl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+reduction+in+electron+tomographic+reconstructions+using+nonlinear+anisotropic+diffusion.">Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion.</a> Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).</li><li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy.">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).</li><li>Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+automatic+noise+reduction+of+electron+tomographic+reconstructions+based+on+iterative+median+filtering.">Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering.</a> Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>MathWorks. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB. , (2012).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).</li><li>Vedaldi, A., Fulkerson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).</li><li>Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Textons?.">What are Textons?.</a> International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).</li><li>Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+intracellular+channel+protein+CLIC5+is+expressed+at+high+levels+in+hair+cell+stereocilia+and+is+essential+for+normal+inner+ear+function.">The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).</li><li>Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+diploid+nontumorigenic+human+breast+epithelial+cell+line+isolated+and+propagated+in+chemically+defined+medium.">A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium.</a> In vitro cellular &amp; developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Shin, J. B., Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+chick+vestibular+hair+bundle.">Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle.</a> Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).</li><li>Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Surface+Models+of+Tubular+Bacteria+and+Cytoskeleta.">Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta.</a> Journal of Information &amp; Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Traditionnellement, la microscopie électronique (EM) domaine a été divisé en 1) la branche de la biologie structurale à l&#39;aide de haut et très haute résolution TEM, généralement combinées avec les données implicites ou explicites moyenne pour enquêter sur l&#39;(3D) structure tridimensionnelle de complexes macromoléculaires avec une composition définie et généralement une taille relativement petite 1-4, et 2) la branche d&#39;imagerie cellulaire dans lequel paysages cellulaires entières sont visualisés 1,5,6. Tandis que la branche structurelle de biologie a connu un développement spectaculaire au cours des quatre dernières décennies, la branche de la biologie cellulaire a été la plupart du temps limitée à deux dimensions, souvent sur des échantillons moins-que-optimale conservés. Seulement avec l&#39;avènement de la tomographie électronique dans la dernière décennie a cellule biologique imagerie ultrastructurale élargi dans la troisième dimension 5,7, où la moyenne ne peuvent généralement pas être effectué comme les paysages cellulaires, et donc les caractéristiques d&#39;intérêt, sont généralement unique. Bien que les scènes cellulaires visualisées sont souvent capte le regard, une extraction efficace des éléments d&#39;intérêt et l&#39;analyse quantitative ultérieure de ces volumes cellulaires très complexes sont à la traîne, en partie parce que la composition de protéines précis est généralement inconnue, rendant donc difficile de les interpréter cellulaire volume 3D. À ce jour, une grande expertise biologique est souvent nécessaire pour interpréter les tomographies complexes, ou même pour identifier les régions importantes et des éléments essentiels dans le volume 3D. Comme une complication supplémentaire, la visualisation de volumes 3D est remarquablement non-trivial. Volumes 3D peuvent être considérés et donc visualisées sous forme de piles d&#39;images 2D. Inspection tranche par tranche d&#39;images 2D séquentielles réduit la complexité, mais il limite également dotées extraction et l&#39;analyse quantitative ainsi les deux dimensions. Cependant, pour la plupart des objets 3D, la représentation des volumes 3D comme un simple empilement de plans consécutifs conduit à une incomplètes uned perspective biaisée en 3D la nature d&#39;un système particulier. Modes alternatifs de l&#39;inspection visuelle nécessitent soit rendu de volume ou de la prestation de surface, qui, étant donné la nature souvent dense d&#39;un cellulaire volume peut facilement conduire à une vue obstruée d&#39;objets imbriqués ou écraser un utilisateur tout à fait, ce qui rend la segmentation manuelle interactive difficile. Pour remédier à ces obstacles, une grande variété d&#39;extraction de fonction automatisée (segmentation) approches ont été développées qui sont généralement soit densimètres ou 8-10 base gradient. Cependant, ces méthodes ont tendance à segmenter le volume entier, quel que soit les zones ou caractéristiques présentent un intérêt pour l&#39;expert, bien que certaines méthodes récentes peuvent cibler un élément spécifique d&#39;intérêt tels que des filaments d&#39;actine 11. De plus, les programmes d&#39;exécution de segmentation automatique peuvent parfois aboutir à la production d&#39;un grand nombre de sous-volumes (par exemple, lors de l&#39;application des bassins versants immersion segmentation) qui ont souvent besoin d&#39;être fusionnés manuellement dans comprenant l&#39;ensemble caractéristique d&#39;intérêt ou être soumis à une nouvelle segmentation. Cela est vrai en particulier pour les ensembles de données complexes et bondés, ainsi algorithmes informatiques les plus rendu sont incapables d&#39;extraire uniquement les éléments d&#39;intérêt avec fidélité, et les efforts de curation substantielles par un expert sont souvent nécessaires pour produire un volume segmenté souhaitée. En outre, des solutions personnalisées à un problème très spécifique sont souvent publiés sous forme d&#39;un document de réunion scientifique, avec peu ou pas l&#39;accent sur ce qui les rend large et des outils complets accessibles aux chercheurs qui n&#39;ont pas une connaissance approfondie des domaines des mathématiques, de l&#39;informatique et / ou infographie. Un environnement logiciel de programmation personnalisable, contenant une gamme de bibliothèques d&#39;analyse d&#39;image, peut être un ensemble d&#39;outils puissants permettant aux utilisateurs d&#39;écrire efficacement leurs propres modules de segmentation précise. Cependant, cette approche nécessite posteformation ensive et une formation en informatique afin de profiter de ses nombreuses fonctionnalités ou les capacités d&#39;analyse d&#39;image. On peut travailler dans un tel environnement logiciel polyvalent pour certains ensembles de données où les caractéristiques sont plus rares, par exemple, en utilisant des approches à base de forme-puissants qui reposent sur ​​la géométrie unique de «modèles» pour séparer les objets d&#39;intérêt de leur entourage 12,13 . Une foire variété de forfaits infographie de visualisation existent pour la segmentation manuel interactif et la construction de modèles. Certains paquets sont disponibles dans le commerce, tandis que d&#39;autres sont d&#39;origine académique et distribués gratuitement, tels que: l&#39;Université de Californie à San Francisco Chimera 14, Université du Colorado MID 15, et de l&#39;Université du Texas Austin VolumeRover 16. Cependant, le large éventail et la complexité des fonctions et capacités de ces programmes possèdent plus raide de la courbe d&#39;apprentissage pour each. Certains programmes de visualisation fournissent des modèles géométriques simples, tels que des billes et des bâtonnets de différentes tailles, qui peuvent être placés dans les cartes de densité afin de créer un modèle simplifié du volume 3D complexe. Ces modèles permettent alors des mesures géométriques et volumétriques simples et donc aller au-delà de l&#39;image &quot;jolie&quot;. Un tel suivi manuel des objets fonctionne bien pour les volumes où seul un petit nombre d&#39;objets doivent être retrouvés et extrait. Cependant, le développement récent de grand volume imagerie ultrastructural 3D utilisant la microscopie électronique à balayage d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisé (FIB-SEM) de 17 à 20 ou la microscopie électronique à balayage de la face de bloc série (SBF-SEM) 21 présente la complication supplémentaire que la taille des données 3D ensembles peuvent aller de gigaoctets à des dizaines et des centaines de giga-octets, et même les téraoctets. Par conséquent, de tels volumes 3D sont pratiquement inaccessibles à l&#39;extraction manuelle de fonction, et donc efficace feat semi-automatique guidé par l&#39;utilisateurextraction ure sera l&#39;un des goulots d&#39;étranglement pour l&#39;analyse efficace des volumes 3D dans un avenir prévisible. Présenté voici quatre approches de segmentation différents qui sont couramment utilisés sur une large gamme de types d&#39;images biologiques. Ces méthodes sont ensuite comparés pour leur efficacité pour différents types d&#39;ensembles de données, ce qui permet une compilation en un guide pour aider les biologistes décident ce qui pourrait être la meilleure approche de segmentation pour l&#39;extraction de caractéristiques efficace de leurs propres données. Comme les manuels d&#39;utilisation détaillés sont disponibles pour la plupart des programmes décrits, le but n&#39;est pas de rendre les utilisateurs potentiels connaissent l&#39;un de ces paquets particuliers. Au lieu de cela, l&#39;objectif est de démontrer les forces et les limites respectives de ces stratégies de segmentation différents en les appliquant à six par exemple des ensembles de données avec des caractéristiques différentes. Par cette comparaison, un ensemble de critères ont été développés qui sont soit basées sur les caractéristiques de l&#39;image de l&#39;objectifEnsembles de données 3D, tels que le contraste des données, la précision, cohue, et de la complexité, ou de la tige de considérations subjectives, comme l&#39;objectif souhaité pour la segmentation, morphologie des fonctionnalités pour être segmentés, la densité de population des éléments d&#39;intérêt, ce qui signifie la fraction de le volume occupé par la fonction d&#39;intérêt, et la façon dont on procède de manière optimale avec des ressources limitées telles que le temps et la disponibilité du personnel. Ces différents ensembles de données d&#39;exemple illustrent comment ces critères objectifs et subjectifs peuvent être appliqués de façon séquentielle dans une variété de combinaisons pour obtenir un appariement de certaines approches d&#39;extraction de caractéristiques avec certains types d&#39;ensembles de données. Les recommandations données, nous l&#39;espérons aider les novices face à une grande variété d&#39;options de segmentation choisir l&#39;approche de segmentation plus efficace pour leur propre volume 3D. Bien que l&#39;accent de cet article est l&#39;extraction de caractéristiques, attention à la collecte de données et prétraitement des données est cruciale pour s efficacesegmentation. Souvent la coloration des échantillons peut être inégale, et, par conséquent, des artefacts de coloration potentiels doivent être pris en considération dans la procédure de segmentation. Toutefois, les taches donne habituellement signal-bruit élevé, et nécessite donc moins de filtrage et autre traitement mathématique des volumes cellulaires, qui pourraient résulter également en artefacts. Les ensembles de données d&#39;images brutes respectives doivent être acquises dans les réglages de contraste et de la caméra pixels corrects, alignés, et reconstruite dans un volume 3D. Pour les tomographies, les images reconstruites sont alignées en utilisant typiquement de rétroprojection pondérée, et ensuite l&#39;ensemble de données est généralement soumis à des algorithmes de débruitage comme non linéaire anisotrope diffusion 22, de filtrage 23 bilatérale, ou médian récursif filtration 24. Données d&#39;imagerie FIB-SEM et SBF-SEM sont alignés par tranches consécutives corrélation croisée dans les programmes utilisant XY tels que ImageJ 25. l&#39;amélioration du contraste et de filtrage peuvent être appliqués pour augmenter les caractéristiques d&#39;intérêt et donc de dé-bruit de la pile d&#39;images. Le filtrage peut être effectué soit sur la totalité du volume de sous-volume avant ou sélection sur les sous-volumes sélectionnés, à l&#39;approche de filtrage peuvent être coûteux en calcul. Sous-échantillonnage des données (binning), qui est parfois utilisé pour la réduction du bruit et / ou le fichier réduction de la taille, est seulement recommandé si les données ont été significativement sur-échantillonné par rapport à la résolution prévue. Après la réduction du bruit, les images traitées peuvent ensuite être segmentés par diverses méthodes, et la mise au point dans cette étude est sur les quatre éléments suivants: (1) Manuel génération de modèle abstrait en créant un modèle de boule-et-bâton, (2) le traçage manuel des caractéristiques d&#39;intérêt, (3) la densité en fonction de seuil automatique, et (4) la segmentation automatique sur mesure via un script pour projet segmentation spécifique. Segmentation limite de 8 et immersive segmentation des bassins versants 10 existe de meilleures alternatives à seuillage simple, mais they appartenir à la même catégorie et n&#39;ont pas été inclus explicitement dans cette discussion. Traçage manuel nécessite de densités présentant les caractéristiques d&#39;intérêt, tranche par tranche, ce qui permet le maintien de la densité initiale des zones de sous-cellulaires respectifs. Cette approche permet un contrôle maximal du processus de segmentation, mais est un processus fastidieux et de main-d&#39;œuvre. Approches de segmentation de la densité (et lié) à seuil automatiques sont semi-automatiques, où un algorithme choisit pixels basé sur un ensemble de paramètres définis par l&#39;utilisateur. Plusieurs (gratuit) paquets de visualisation d&#39;enseignement, tels que l&#39;UCSF Chimera, MID, Fidji 26, et VolumeRover sont disponibles, ainsi que commercial (nécessitant licences payées) des paquets, et les deux types comprennent généralement un ou plusieurs de ces approches de segmentation. Les logiciels utilisés dans ce travail pour illustrer ces différentes méthodes comprennent à la fois des programmes commerciaux et s ouvertes académiquesource programmes pour générer manuellement un modèle théorique, ainsi que le manuel et automatisé de segmentation densité. Cependant, les logiciels open source peut parfois offrir des options plus avancées grâce à la possibilité de personnalisation. Une comparaison de ces techniques à l&#39;aide de différents types d&#39;ensembles de données conduit à la présentation qui suit des règles et des conseils sur la façon d&#39;aborder la segmentation des divers volumes 3D de données biologiques, qui à notre connaissance n&#39;a pas encore été publiés. Ainsi, c&#39;est la première comparaison systématique des différentes approches et leur utilité sur des ensembles de données possédant des caractéristiques variées pour les utilisateurs ayant des objectifs différents.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Material Name</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Amira</td>
			<td style="width:151px;">FEI Visualization Sciences Group</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:99px;">Chimera</td>
			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

Méthodes de microscopie électronique 3D modernes ont récemment permis analyse sans précédent dans l&#39;organisation ultrastructurale 3D de cellules et de tissus, ce qui permet la visualisation de grandes machines macromoléculaires, tels que les complexes d&#39;adhérence, ainsi que les structures d&#39;ordre supérieur, tels que le cytosquelette et des organites cellulaires dans leur cellule respective et le contexte tissulaire. Compte tenu de la complexité inhérente des volumes cellulaires, il est essentiel de d&#39;abord extraire les caractéristiques d&#39;intérêt afin de permettre la visualisation, la quantification, et donc la compréhension de leur organisation en 3D. Chaque jeu de données est définie par des caractéristiques distinctes, par exemple, le rapport signal-sur-bruit, netteté (netteté) des données, l&#39;hétérogénéité de ses fonctions, entassement des caractéristiques, la présence ou l&#39;absence de formes caractéristiques qui permettent d&#39;identifier facilement, et le pourcentage de la totalité du volume qu&#39;une région d&#39;intérêt spécifique occupe. Toutes ces caractéristiques doivent être considéréesau moment de décider sur l&#39;approche à adopter pour la segmentation. Les six ensembles de données ultrastructurale 3D différents présentés ont été obtenus par imagerie en trois différentes approches: la tomographie électronique teinté intégré de résine, d&#39;ions focalisé BEAM et la microscopie électronique à balayage face-bloc de série (FIB-SEM, SBF-SEM) des échantillons légèrement colorées et fortement colorées , respectivement. Pour ces ensembles de données, quatre approches de segmentation différentes ont été appliquées: (1) le renforcement entièrement manuel modèle suivi uniquement par la visualisation du modèle, (2) le traçage manuel segmentation des données suivies par la fonte de surface, (3) des approches semi-automatiques suivies par le rendu de surface, ou des algorithmes de segmentation conçu sur mesure (4) automatisés suivis par la fonte de surface et de l&#39;analyse quantitative. En fonction de la combinaison de caractéristiques d&#39;ensemble de données, il a été constaté que généralement l&#39;une de ces quatre approches catégoriques surpasse les autres, mais en fonction de la séquence exacte de critères, more d&#39;une approche peut être couronnée de succès. Sur la base de ces données, nous proposons un système de triage qui permet de classer les objectifs caractéristiques des ensembles de données et des critères subjectifs personnels pour l&#39;analyse des différents ensembles de données.

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From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Le goulot d&#39;étranglement pour la microscopie électronique 3D cellulaire est l&#39;extraction de caractéristiques (segmentation) dans des cartes très complexes de densité 3D. Nous avons développé un ensemble de critères, qui fournit des précisions sur l&#39;approche de segmentation (manuel, semi-automatique ou automatique) est le mieux adapté pour différents types de données, fournissant ainsi un point de départ pour la segmentation efficace.

De voxels à la connaissance: Un guide pratique de la segmentation du complexe microscopie électronique 3D-données

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

from-voxels-to-knowledge-practical-guide-to-segmentation-complex

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K vues.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  Le goulot d'étranglement pour la microscopie électronique 3D cellulaire est l'extraction de caractéristiques (segmentation) dans des cartes très complexes de densité 3D. Nous avons développé un ensemble de critères, qui fournit des précisions sur l'approche de segmentation (manuel, semi-automatique ou automatique) est le mieux adapté pour différents types de données, fournissant ainsi un point de départ pour la segmentation efficace. 

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Recherche

Bio-ingénierie

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescence-trempe d&#39;un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Un guide pour structuré Illumination FRBR Microscopie à haute vitesse avec plusieurs couleurs

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Corrélatives microscopie électronique léger (CLEM) de suivi et d’imagerie protéine virale associés Structures des cellules immobilisées Cryo

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Un Guide pour construire un très inclinée a balayé la tuile Microscope pour l’imagerie de molécule unique champ de vision étendu

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...