Les propriétés biomécaniques des cellules et des tissus régulent leur fonction et leur vitalité. L’AFM permet la quantification précoce de l’arthrose au niveau cellulaire basée sur des mesures d’élasticité. L’AFM permet l’acquisition de mesures au niveau cellulaire sans endommager l’échantillon et avec une haute résolution, fiabilité et sensibilité.
Les changements de propriété biomécanique se produisent tôt dans l’ostéoarthrite. La mesure de l’élasticité locale du cartilage articulaire permet de tirer des conclusions valables sur le degré de dégénérescence des tissus locaux. Pour évaluer les changements dégénératifs dans l’articulation du genou humain, utilisez d’abord un scalpel pour couper le cartilage articulaire dans son ensemble de l’os subchondral et intégrer l’échantillon de cartilage dans le milieu d’intégration soluble dans l’eau sur le bouton Cryotome qui gèle sous basse température dans le dispositif Cryotome.
Lorsque l’échantillon est gelé, utilisez un Cryotome standard pour acquérir une section de tissu de 35 micromètres d’épaisseur à partir de la couche supérieure du cartilage articulaire, recueillant chaque section sur des toboggans en verre individuels. Lorsque toutes les sections ont été obtenues, rincer les échantillons trois fois dans du PBS frais pendant cinq minutes par lavage pour enlever le milieu d’intégration soluble dans l’eau. Retirer la première diapositive du lavage.
Après cela, ajouter deux à trois gouttes de colle d’échantillon biocompatible par section dans des boîtes de Pétri compatibles avec l’AFM. Retirez tout excès de solution de l’échantillon et appuyez doucement sur les bords de la section séchée sur les taches de colle. Après deux minutes, couvrir soigneusement les tissus collés avec le milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine et placer les plats dans un incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les échantillons doivent être analysés.
Pour préparer l’appareil AFM, ajustez un bloc de gaz pour mesurer dans un environnement liquide sur le support AFM à ce que la surface supérieure est parallèle au support, et utilisez des pinces à épiler pour monter soigneusement le porte-à-faux sélectionné sur la surface du bloc de verre de sorte que la pointe AFM avec la microsphère dépasse sur le plan optique poli. Pour stabiliser le porte-à-faux sur le bloc de verre, faites glisser le ressort métallique dans la rainure du bloc et utilisez des pinces à épiler pour serrer le dessus du porte-à-faux avec le ressort. Placez soigneusement le bloc de verre avec le porte-à-faux sur la tête de l’AFM et fixez le bloc avec le mécanisme de verrouillage intégré.
Montez ensuite la tête de l’AFM avec le porte-à-faux sur l’appareil AFM avec le ressort orienté vers la gauche. Pour monter l’échantillon sur l’appareil AFM, placez l’échantillon de boîte de Petri sur le porte-échantillon AFM et réglez le chauffe-vaisselle Petri à 37 degrés Celsius. Après environ 20 minutes, ouvrez le logiciel de l’appareil et l’alignement laser et approchez les fenêtres de réglage des paramètres.
Ensuite, allumez le moteur stepper, la lumière laser et la caméra CCD et utilisez la fonction moteur stepper pour abaisser le porte-à-faux en 100 étapes de micromètre jusqu’à ce que le porte-à-faux soit complètement immergé dans le milieu. Utilisez les vis d’ajustement pour diriger le laser sur le dessus du porte-à-faux et utilisez les vis du dispositif AFM pour régler le faisceau laser de sorte que le faisceau réfléchi tombe sur le centre du photodétecteur. Une fois que le porte-à-faux laser a été ajusté, réglez le photodétecteur au besoin pour régler le signal de somme à un volt ou au-dessus et les déviations latérales et verticales à près de zéro.
Pour obtenir la courbe de force d’étalonnage, exécutez une approche scanner avec les paramètres d’approche indiqués dans le tableau. Une fois que le fond du plat de culture tissulaire est atteint, rétractez le porte-à-faux de 100 micromètres. Configurer les paramètres d’exécuter comme indiqué dans le tableau.
Et cliquez sur exécuter pour démarrer une mesure et pour obtenir une courbe de distance de force d’étalonnage. La courbe de force est obtenue comme illustré dans la figure. Sur la courbe de distance de force d’étalonnage, sélectionnez la région pour un ajustement linéaire de la courbe rétractée.
Une fois que l’ajustement linéaire est en place, les valeurs seront enregistrées par le logiciel. Ensuite, comme les mesures sont effectuées en moyenne à 37 degrés Celsius de température, réglez la variable de température dans le logiciel à 37 degrés pour imiter les conditions physiologiques aussi étroitement que possible. Pour identifier les modèles conversites dans les sections d’échantillon de cartilage, localisez et identifiez les modèles cellulaires spécifiques du cartilage articulaire du genou arthrose sur le microscope de contraste de phase, qui peut inclure des cordes simples indicatives des secteurs sains de tissu, des doubles cordes indicatif du début de la dégénérescence de tissu, de petits amas, qui sont des signes de dégénérescence avancée de tissu, et de grands amas, indicatifs de destruction de tissu de phase finale.
Une fois qu’un modèle spécifique désiré a été identifié, pour les mesures de matrice péricellulaire, placez le porte-à-faux à proximité des cellules et mesurez deux emplacements par modèle choisi par type de matrice, neuf fois par site de mesure, y compris une taille d’échantillon suffisamment grande pour tenir compte des inexactitudes possibles. Concentrez-vous sur la matrice cellulaire du modèle à mesurer et à fixer la souris de l’ordinateur à ce moment-là. Ensuite, concentrez-vous sur la sonde et déplacez la pointe de la sonde au point précédemment fixé par la flèche de l’ordinateur.
Pour effectuer des mesures de la matrice extracellulaire, sélectionnez une région sans cellules et effectuez une approche suivie d’une rétractation de sorte que le porte-à-faux soit positionné à 100 micromètres au-dessus du tissu. Cliquez ensuite sur exécuter pour démarrer les mesures, en utilisant le paramètre de point défini obtenu par étalonnage du porte-à-faux. Pour traiter les données obtenues, ouvrir un logiciel de traitement des données compatible avec les données obtenues à partir de l’appareil AFM et sélectionner le modèle Hearst dans le logiciel pour le traitement des courbes de distance de force.
Réglez le rapport Poisson à 0,5, la forme de la pointe comme sphérique, et le rayon de pointe à 12,5 micromètres. Une fois que tous les paramètres auront été ajustés, les résultats seront ajustés et le Modulus du Jeune sera calculé par le logiciel. Le long du modèle physiopathologique, des cordes aux doubles cordes et des petites aux grandes grappes, le moduli élastique de matrice extracellulaire et péricellulaire diminue considérablement entre chaque changement de motif, sauf entre les cordes et les doubles cordes.
En outre, le rapport de matrice extracellulaire-péricellulaire ne change pas de manière significative, tandis qu’une diminution marquée des différences absolues d’élasticité entre les matrices extracellulaires et péricellulaires est observée. Les valeurs d’élasticité dépendent de diverses conditions telles que la profondeur d’indentation ou les propriétés de pointe en porte-à-faux. AFM est donc le mieux adapté à la comparaison de conditions différentes dans la même configuration expérimentale.
Comme l’AFM mesure l’élasticité locale de l’échantillon, les sections doivent être fixées afin de permettre des mesures précises et d’éviter les dommages causés par le porte-à-faux. Pour analyser davantage les processus responsables des changements d’élasticité des tissus, la quantification biochimique de la structure des protéines d’intérêt peut être effectuée par l’intermédiaire de taches occidentales ou d’ELISAs.
