Notre méthode nous permet de visualiser des molécules simples avec une surface d’image 40 fois plus grande que les méthodes conventionnelles, et a un signal de fond considérablement réduit. Contrairement à d’autres techniques, notre approche utilise une lentille objective unique, ne nécessite pas une chambre d’échantillon spéciale, et il est facilement compatible avec les systèmes de microscope commercial. Après avoir recueilli les composants nécessaires commencer à construire le système.
Ici, plusieurs éléments sont déjà en position sur le banc. Monté sur un bloc d’aluminium est un corps microscope avec un stade Piezo et porte-échantillon. Aussi sur le banc sont trois lasers et des éléments optiques pour combiner les faisceaux.
Les faisceaux combinés sont couplés à une fibre de mode unique aussi efficacement que possible. En dernière étape préliminaire, assemblez une source lumineuse collimée dans un système de cage. Il s’agit d’une source de lumière cohérente temporaire reliée à une fibre de mode unique, à un adaptateur de fibre, à une lentille achromatique et à un iris.
Commencez à travailler avec le chemin de détection. Tout d’abord, placez la source lumineuse collimée dans le port objectif du corps microscope. Ajustez le miroir sous les objectifs de sorte que le faisceau de sortie est à peu près horizontal et aligné avec les trous du banc.
Insérez un miroir dichroïque dans le chemin du faisceau et réfléchissez le faisceau de 90 degrés. Ajoutez des miroirs pour permettre l’ajustement du chemin du faisceau transmis à une caméra sCMOS. Utilisez les miroirs pour vous assurer que le faisceau frappe le centre de la puce.
Ensuite, insérez un objectif de tube focal de 300 millilitres sur une longueur focale de la caméra. Retirez la source lumineuse collimée du corps du microscope. Ajustez ensuite la position de la lentille du tube afin de régler son plan focal.
Arrêtez les réglages lorsque la caméra résout clairement le motif sur le plafond. Le chemin de détection est représenté dans ce schéma. Notez l’ajout d’un filtre de passage multi-bandes avant l’objectif du tube pour l’imagerie par fluorescence multicolore.
Retournez au corps du microscope. Là, réinstallez la source lumineuse collimée dans le support objectif. Après le miroir dichroïque, placez un miroir pliant sur le chemin du faisceau réfléchi pour le rediriger de 90 degrés.
Retirez la source lumineuse collimée du corps du microscope et placez-la à proximité. Ensuite, insérez une lentille focale de 400 millimètres à environ une longueur focale du miroir. Au corps du microscope installer la lentille objective.
Ajustez ensuite la position du miroir le long de l’axe optique. Observez le plafond au-dessus de l’objectif et arrêtez-vous lorsqu’un motif de disque aéroy parfait s’y forme. Maintenant, retirez l’objectif et réinstallez la source lumineuse collimée avec un iris ouvert.
Déterminez où, le long du chemin de faisceau, le faisceau est le plus petit à environ 400 millimètres du miroir. Une fois le point identifié, montez un miroir là, un plan d’image conjugué. L’état de la mise en place à ce stade apparaît dans ce schéma.
Le miroir qui vient d’être ajouté est étiqueté M5. Insérez un autre miroir pour refléter le faisceau de 90 degrés et monter une lentille focale de 150 millimètres au-delà. L’objectif doit être à 150 millimètres du plan d’image conjugué. Ensuite, enlever temporairement la première lentille dans le chemin de faisceau d’excitation.
Avec cette configuration trouver la position focale de la deuxième lentille. Placez un miroir galvo à axe unique à ce point focal comme un plan focal arrière conjugué. Fournir zéro volts au miroir galvo et faire pivoter son support de sorte qu’il reflète le faisceau de 90 degrés.
Ensuite, le long du chemin du faisceau, placez un miroir pliant qui reflète le faisceau à 90 degrés. Placez la lentille 100 millimètres le long de la trajectoire du faisceau à partir du plan focal arrière conjugué. Encore une fois, retirez la source lumineuse collimée de la monture du microscope.
Ajouter une autre lentille de collimation de 100 millimètres avec un adaptateur de fibre et une fibre de mode unique avec un iris. Ensuite, utilisez l’iris, la fibre et la lentille pour envoyer un faisceau collimated à travers le système d’imagerie. Ensuite, insérez une lentille cylindrique de longueur focale de 400 millimètres juste avant la dernière lentille de collimation dans le chemin du faisceau.
Utilisez-le pour concentrer le faisceau. Insérez une lentille cylindrique de 50 millimètres de 450 millimètres devant la première. Il s’agit d’une représentation schématique de la configuration finale avec à la fois les chemins de détection et d’excitation.
La sortie des trois lasers est couplée dans le chemin par la fibre de mode unique. Pour les tests préparer un échantillon d’hydrogel 3D. Celui-ci se compose de perles pourpres de 20 nanomètres mélangées avec de l’hydrogel.
À la configuration placer l’échantillon d’hydrogel dans le porte-échantillon. Pour l’excitation de l’échantillon allumer le laser de 638 nanomètres et ajuster sa puissance à moins d’un milliwatt. Configurez le logiciel de contrôle de la caméra en mode déclencheur interne et capturez la vidéo.
À ce stade, le moteur galvo a zéro volts appliquées. Placez la caméra de sorte que l’image est au centre de l’objectif. Ensuite, ajustez le miroir qui est le plan d’image conjugué.
Faites pivoter le bouton horizontal sur le miroir afin d’obtenir un éclairage fortement incliné. Enregistrez l’image de tuile comme dans l’image de fluorescence d’échantillon de l’hydrogel 3D avec des perles de 20 nanomètres. La barre d’échelle est de 20 micromètres.
Procéder après la mise en place du matériel et des logiciels pour balayer le miroir galvo. Il s’agit du logiciel de balayage miroir galvo pour la configuration. Organisez l’imagerie complète sur le terrain en fixant Vmin à moins 500 millivolts.
Réglez ensuite Vmax à 500 millivolts. Ensuite, passez au logiciel d’acquisition de caméra. En mode Déclenchement sélectionnez Externe.
Sous le menu lightscan plus drop-down sélectionnez Down Next, cliquez sur Contrôle de vitesse de balayage. Certains paramètres de contrôle peuvent maintenant être définis. Sous la hauteur de fenêtre entrer 180 rangées.
Sous exposition entrer 28 millisecondes. Une fois terminé, retournez au logiciel de contrôle miroir. Dans le logiciel de contrôle miroir allumer les piles 3D ON. Spécifiez le nombre de piles et la taille de l’étape.
Cliquez sur prendre la vidéo pour commencer à enregistrer des images. Il s’agit d’un exemple d’imagerie Epi de l’ADN étiqueté à brin unique. En revanche, la technique très inclinée de tuile balayée a produit cette image.
L’image HIST montre moins d’arrière-plan par rapport à l’image Epi. L’ADN est dans un hydrogel 3D, et la longueur d’onde excitation est de 638 nanomètres. Voici une image Epi du facteur d’allongement de traduction eucaryotique étiqueté 2.
L’image HIST a amélioré le rapport signal-arrière-plan. Il a également un éclairage plus uniforme. Les deux ont la même puissance d’éclairage de 7,5 milliwatts.
Les vitesses d’imagerie étaient toutes deux de 2,5 images par seconde. Il est important de garder constamment un angle d’inclinaison élevé, et synchroniser le miroir de balayage avec la lecture de la caméra. Cela garantit un ratio signal/arrière-plan élevé lors de l’acquisition d’images.
Nous nous attendons à ce que la microscopie HIST bénéficie de plusieurs applications, y compris l’imagerie à super résolution à des profondeurs d’imagerie plus profondes et le profilage d’expression des gènes à haut débit dans les tranches épaisses des tissus.
