Ce travail a été soutenu par le prix de l&#39;innovation Eagles (Ordre Fraternel des Aigles) et par la Fondation Mayo.

** Ce protocole vidéo est basée sur une publication associée 1: haute sensibilité de détection et d&#39;analyse quantitative de la maternelle interactions protéine-protéine et de complexes multiprotéiques par cytométrie en flux. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. STKE Science 2007 (389): PL2 5 Juin 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette publication</a> . Avant de partir, Préparer les solutions suivantes Stock aqueux: <table><tbody><tr><td> MES tampon de couplage: </td><td> Conserver à 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Trempe / Blocage / Stockage (SBQ) Tampon: </td><td> Conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> L&#39;azide de sodium </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Tampon FCM: </td><td> Conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> L&#39;azide de sodium </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Préparer immédiatement avant l&#39;utilisation: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> Dissoudre 50 mg / mL dans la poudre EDAC MES tampon de couplage </td></tr><tr><td> Digitonine solution (2% p / v): </td><td> Dissoudre la poudre digitonine en DH 2 O par chauffage à 95 ° C pendant 5min puis refroidir sur glace </td></tr><tr><td> Tampon de lyse: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Solution de digitonine </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Inhibiteurs de protéase </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Restez sur la glace </td><td></td></tr></tbody></table> 1. Couplage des mAb aux Perles <ol><li> Déterminer la concentration de perles à partir du stock acheté par dilution dans du PBS et de compter avec un hématimètre. Commencez avec une dilution 1:10000 de perles pour le comptage. </li><li> Pipeter 18 x 10 6 billes dans un microtube de 1,5 ml. </li><li> Laver les billes 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de tampon de couplage MES, centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage. </li><li> Resuspendre les perles dans 50 uL tampon de couplage MES. </li><li> Activer les groupes carboxyle sur les billes en ajoutant 20 uL d&#39;fraîchement préparés EDAC-MES. </li><li> Mélanger doucement pendant 15 min à 25 ° C manuellement en aspiration et refoulement. </li><li> Laver les billes activées 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de PBS, la centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage. </li><li> Resuspendre les perles activé dans 50 ul de PBS. </li><li> Ajouter 50 uL de la propriété intellectuelle mAb (à 0.2 à 1.0 de concentration mg / ml) à la solution activée perle. </li><li> Mélanger pendant 3 à 4 heures à 25 ° C en plaçant le tube sur un vibrant shaker. Agiter suffisamment pour empêcher la sédimentation des perles sur le fond du tube. </li><li> Lavez-mAb couplée perles 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de PBS, la centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage. </li><li> Resuspendre les perles dans 100 uL de tampon QBS. Ceux-ci peuvent être conservés à 4 ° C. </li><li> Suspension des billes ainsi, diluer 1:200-1:10,000 dans du PBS et compter avec un hématimètre. La concentration doit être mesurée pour chaque lot de préparation, de sorte que le nombre de billes utilisées dans chaque expérience IP ou pull-down peut être contrôlée avec précision. </li></ol> 2. Préparation lysat post-nucléaire et Ip La méthode de lyse et les conditions de lyse optimale dépendra du type cellulaire et interactions protéine-protéine à l&#39;étude. Un certain nombre de protocoles existent et peuvent être modifiés à votre application. <ol><li> Lyse 20 x 10 6 «petites» cellules, comme les lymphocytes, ou 5 x 10 6 «grandes» cellules, telles que les macrophages ou les cellules tumorales, dans 100 uL de tampon de lyse frais dans un microtube de 1,5 mL pour 20min sur la glace. Échelle du volume lyse des besoins. </li><li> Pour retirer les noyaux et débris cellulaires insolubles, centrifuger le lysat à 20.000 g pendant 10 min à 4 ° C. Gardez le surnageant et jeter le culot. </li><li> Ajouter 0,5 x 10 5 à 2,5 x 10 5 mAb couplée perles au lysat clarifié, pipetage doucement pour mélanger. Le volume minimal que nous utilisons poureffectuer une seule adresse IP est de 5 ul. </li><li> Placer sur une roue de rotation vertical 4 heures pour une nuit dans une chambre froide. Réglez la vitesse suffisante pour empêcher les perles de s&#39;installer. Il est acceptable pour le liquide de faible volume IP de rester dans le fond du tube pendant la rotation. </li></ol> 3. Sondage du talon-capturé des protéines avec des anticorps conjugués au fluorochrome <ol><li> Laver les billes IP deux fois dans 0,2 à 1,0 ml de tampon glacé de la FCM, centrifugation à 20000 g à 4 ° C pendant 3 min après chaque lavage. </li><li> Resuspendre les billes en 100 FCM tampon et aliquot uL 20 uL dans chacune des cinq ou plus des microtubes de 1,5 ml ou puits d&#39;une plaque de cheminée à fond. </li><li> Ajouter fluorochrome conjugués anticorps monoclonaux aux échantillons. Effectuez la FCM tache selon les instructions du vendeur ou en fonction de la concentration déterminée empiriquement. Comme point de départ, ajouter 0,2 à 1 microlitre de solution d&#39;anticorps de stock (à 0,2 à 1,0 mg / mL) par tube ou un puits, et incuber pendant 40 min sur la glace. </li><li> Lavez sondé perles dans des tubes de 1,5 ml deux fois dans 1,0 ml de tampon FCM glacée, centrifugation à 20000 g à 4 ° C pendant 3 min après chaque lavage. Retirer délicatement le surnageant après chaque lavage, en prenant soin de ne pas déranger les perles. Pour une plaque de cheminée à fond, se laver deux fois avec 0,2 ml de tampon glacé de la FCM, centrifugation à 1000g pendant 5 min à 4 ° C après chaque lavage. Une pipette multicanaux est utile pour cette étape. Pour retirer le surnageant à partir de perles dans une plaque de cheminée à fond, «flick» la plaque une fois, puis, tout à l&#39;envers, éponger les gouttes sur les bords du puits. Le volume résiduel dans chaque puits, contenant les billes, sera d&#39;environ 20 pl. </li><li> Resuspendre les perles dans 200 uL de tampon de la FCM par échantillon. Transfert à l&#39;étiquetage des tubes FACS. Les échantillons sont maintenant prêts pour la FCM. </li></ol> 4. Acquisition de la FCM Les perles de LMC décrite dans ce protocole sont de 3 à 5 microns de diamètre, soit environ la moitié du diamètre d&#39;un lymphocyte de souris au repos. Par conséquent, il peut être nécessaire d&#39;augmenter manuellement le Forward Scatter (FSC) et le gain de l&#39;ampli Side Scatter (SSC) de tension pour que la population d&#39;événements billes de s&#39;inscrire sur une échelle. Individuels perles IP devraient former une seule population étroitement groupés. Les réglages et les portes doivent être ajustées afin d&#39;exclure doublets billes et des débris. <ol><li> Avant de perles course ou normes perle, retirer le manchon de confinement qui entoure la goutte d&#39;entrée d&#39;échantillon sur certains cytomètres. Laisser le liquide de gaine goutte à goutte entre les échantillons, comme cela sera clair d&#39;entrée et de prévenir les perles d&#39;être reportés d&#39;un échantillon à l&#39;autre. </li><li> Utilisez des perles sans étiquette, un contrôle négatif de la fluorescence, et des particules d&#39;étalonnage Rainbow (PCR), un contrôle positif de la fluorescence, d&#39;ajuster les réglages de sorte que les deux extrêmes négatifs et positifs de fluorescence apparaissent simultanément sur le journal échelle axe des abscisses. Cela garantit que la fluorescence à partir des échantillons expérimentaux seront également sur l&#39;échelle. Notez que les PCR sont plus petits que les grains atteints de LMC, alors FSC et SSC paramètres, ainsi que la position de grille, peut-être besoin d&#39;être modifié temporairement pour cet échantillon. </li><li> Retour au sans étiquette-billes paramètres une fois l&#39;étalonnage avec PCR est terminée. Si une seule sonde fluorescente par échantillon est utilisée, aucune compensation de fluorescence est nécessaire. En général, nous sondons complexes multiprotéiques avec un seul fluorochrome conjugués AcM par échantillon de la FCM, et nous examinons les partenaires d&#39;interaction de plusieurs échantillons en parallèle par une coloration perle avec des Acm spécifiques pour les sous-unités différentes. </li><li> Acquérir et enregistrer la fluorescence des fichiers de données. L&#39;analyse peut ensuite être effectuée en utilisant un logiciel de cytométrie en flux tels que CellQuest, FlowJo ou cflow. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. IP-FCM pour TCR/CD3 complexe multiprotéique. Lymphocytes T de la souche de souris Balb / c ont été lysées dans digitonine à 1%, et le lysat a été soumis à IP-FCM utilisant des anticorps anti-CD3ε perles. Les complexes capturé contenait des quantités importantes de TCR-β (région violet) et co-associé CD3-ε (vert), mais à proximité de niveaux de fond (défini par la sonde d&#39;immunoglobulines non pertinents, rose trace) d&#39;autres protéines telles que Thy1.2, CD45, ou H-2K (d) (marron, orange, et des traces bleues, respectivement). Voir similaires résultats publiés antérieurement 1-6.

<ol>
	<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains.">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8++memory+versus+effector+development.">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li><li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and/or+calcium+store+depletion.">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li><li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes.">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li></ol>

Informations sur les interactions protéine-protéine est très pertinente pour l&#39;analyse de nombreux processus cellulaires tels que la transduction du signal, la maturation lignée, progression du cycle cellulaire, l&#39;apoptose et de cascades. IP-FCM offre un moyen rapide, quantitative, et sensible à examiner l&#39;interaction de protéines et de définir les membres de complexes multiprotéiques dans leur conformation native. Perles peuvent être couplés et incubées avec des lysats de cellules en une seule journée et peut être sondé et analysé le lendemain. Un format de plaque de 96 puits permet un grand nombre d&#39;échantillons à analyser à la fois pour fournir efficacement la collecte des données à des fins statistiques ou de dépistage. Utiliser fluorescents standards perle, le nombre de protéines capturées par chaque perle peut être estimé. Très peu d&#39;matériel source est nécessaire pour la capture et la détection, afin d&#39;échantillons limités et rares analytes peuvent encore être analysés pour de multiples interactions. Bien que IP-FCM n&#39;a pas besoin du génie génétique, épitope-tagging, la dénaturation, ou in vitro de mélange de protéines dans un environnement non-physiologique, il peut être couplé avec ces techniques et d&#39;autres, ce qui en fait un outil précieux et accessible avec applicabilité à de nombreux systèmes biologiques. Dépannage: Beaucoup IP FCM expériences génèrent des données utiles interaction protéine la première fois qu&#39;ils sont tentées. Cependant, l&#39;optimisation de la PI-FCM peut améliorer la conjugaison d&#39;anticorps à des perles, la capture des protéines complexes et sonde fluorescente contraignant. L&#39;efficacité de la conjugaison d&#39;anticorps IP peuvent être déterminées en sondant billes couplées directement avec un anticorps anti-immunoglobulines. Si ce rendement est faible, ce qui augmente la concentration d&#39;anticorps lors de la réaction de couplage peut permettre anticorps plus IP à attacher à chaque bille. Cela peut augmenter la capacité de liaison des lots IP perle, entraînant la capture améliorée et la détection des analytes. Autres primaires-amine contenant des molécules (par exemple Tris, sérum albumine bovine) ne devraient pas être présents lors de la réaction de couplage, car ils peuvent rivaliser avec les mAb pour fixation de perles et entraîner des mAb faible couplage. Si la conjugaison de mAb à des billes s&#39;avère problématique pour d&#39;autres raisons, les perles peuvent plutôt être couplé à l&#39;avidine / streptavidine, et des anticorps biotinylés peuvent ensuite être non covalente et utilisé pour immunprecipitation. Malgré une bonne conjugaison d&#39;anticorps, la détection initiale des billes associées à fluorescence peut être faible. Premièrement, la capture complexe lui-même peut être faible. Parce que IP-FCM dépend de la concentration des analytes, l&#39;augmentation du nombre de cellules lysées par volume unité de lyse peut augmenter la capture et la détection analyte. De plus, la capture peut être améliorée en diminuant le nombre de billes IP incubées avec le lysat, qui distribue les complexes capturés dans moins de perles, et les résultats de la fluorescence moyenne a augmenté par bille lorsque sondé. Deuxièmement, il est possible que l&#39;accès de l&#39;anticorps sonde pour les complexes capturée est stériquement encombrés par l&#39;anticorps immunoprécipiter. Dans ce cas, le problème peut être résolu en utilisant des anticorps différents pour capturer et / ou de la sonde.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes</td>
<td>2-5000</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rainbow Calibration Particles</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spherotech, Inc.</td>
<td>RCP-30-5A</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-5287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce Sigma</td>
<td>22980 E-6383</td>
<td>Store at -20&deg;C under desiccating conditions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-2714</td>
<td> Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20&deg;C. Handle with gloves.</td>
</tr>
<tr>
<td>PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-408-230</td>
<td>For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ip-fcm:  immunoprecipitation detected by flow cytometry

Immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux (IP-FCM) est une méthode efficace pour détecter et quantifier les interactions entre protéines. Le principe de base vaut celle d&#39;ELISA en sandwich, dans lequel l&#39;analyte capturé primaire peut être détecté avec d&#39;autres molécules physiquement associés au sein de complexes multiprotéiques. La procédure implique le couplage covalent de microbilles de latex de polystyrène avec immunoprécipiter anticorps monoclonaux (mAb) spécifique pour une protéine d&#39;intérêt, l&#39;incubation de ces perles avec des lysats cellulaires, sondant les complexes protéiques capturé avec fluorochrome conjugués des sondes, et l&#39;analyse des billes associées à fluorescence par cytométrie en flux. IP-FCM est extrêmement sensible, permet l&#39;analyse des protéines dans leur langue maternelle (non dénaturé) État, et est susceptible d&#39;être soit l&#39;analyse semi-quantitative ou quantitative. Comme autres avantages, IP-FCM ne nécessite pas de génie génétique ou de l&#39;équipement spécialisé, sauf un cytomètre en flux, et il peut être facilement adapté pour applications à haut débit.

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

La méthode IP-FCM est présenté, ce qui permet un sensible, robuste, l&#39;évaluation biochimique de la maternelle interactions protéine-protéine, sans exiger le génie génétique ou échantillons de grande taille.

IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K vues.  Mayo Clinic. La méthode IP-FCM est présenté, ce qui permet un sensible, robuste, l'évaluation biochimique de la maternelle interactions protéine-protéine, sans exiger le génie génétique ou échantillons de grande taille.

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Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Recherche

Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Mesurer d’endoréduplication par cytométrie de flux des protoplastes isolés Tuber

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Haut débit mesure de Dictyostelium discoideum macropinocytose par cytométrie en flux

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.