Nous remercions T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, et I. Shestopalov pour les discussions. Soutenu par l&#39;Agence de la Science, la Technologie et de la recherche de Singapour (CC), NIH R01 et R01-CA118750-HG004361 (HYC), et le California Institute for Regenerative Medicine (HYC). HYC est un scientifique en début de carrière de l&#39;Institut médical Howard Hughes.

1. Conception de la sonde Conception d&#39;ADN anti-sens de carrelage sondes pour la récupération sélective de l&#39;ARN cible par Chirp. <ol><li> Sondes de conception oligo anti-sens en utilisant le concepteur de sonde en ligne à <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Utilisez ces paramètres: nombre de sondes = 1 / sonde de 100 pb de longueur ARN; 2) Cible GC% = 45; longueur Espacement 4) = 60-80; 3) Longueur = 20 oligonucléotides. Pause d&#39;ARN dans les segments s&#39;il est trop long pour le concepteur. Omettre régions de répétitions ou d&#39;homologie étendue. </li><li> Sondes d&#39;ADN de commande anti-sens avec BiotinTEG à 3-Premier fin. </li><li> Des sondes marqueurs en fonction de leurs positions le long de l&#39;ARN. Séparez-les en deux poules de sorte que le &quot;même&quot; pool contient toutes les sondes au nombre de 2, 4, 6, etc, et le «bizarre» pool contient des sondes au nombre de 1, 3, 5, etc Diluer pool de sondes à une concentration de 100 uM et conserver à -20 ° C. </li><li> Toutes les expériences doivent être effectuées à l&#39;aidedeux piscines, qui servent de contrôles internes pour l&#39;autre. Réel ARN-dépendante du signal serait présent à partir de deux piscines, tandis que la sonde spécifiques bruits serait propre à chaque piscine. Ceci s&#39;applique à la fois pour chirp-qPCR et CHIRP-seq. </li></ol> 2. Les cellules de récolte Recueillir les cellules qui seront utilisées pour l&#39;expérience gazouiller. <ol><li> Cultiver les cellules dans des plaques de culture de tissus ou des flacons à la confluence. Rincer avec un tampon phosphate salin (PBS) et une fois trypsiniser. Quench trypsine avec un volume&gt; 2x des médias, une pipette de haut en bas pour déloger les cellules et remettre en suspension seule cellule. Transférez tous les médias et les cellules remises en suspension dans 50 ml tubes Falcon. 20 millions de cellules sont généralement suffisante pour un échantillon gazouiller. </li><li> Spin cellules à 800RCF pendant 4 min. Aspirer les médias et remettre 40 millions de cellules dans 40 ml de PBS, de combiner les tubes si nécessaire. Spin cellules à 800RCF pendant 4 min. Décanter PBS, aspirer délicatement sur un angle du liquide restant. </li></ol&gt; 3. Croix-lier des cellules et collecte culot cellulaire Crosslink recueillies cellules avec du glutaraldéhyde à préserver l&#39;ARN-chromatine interactions et de préparer culot cellulaire. <ol><li> Effectuez toutes les étapes à température ambiante. </li><li> Préparer glutaraldéhyde à 1% à température ambiante PBS. Préparer 10 ml par 10 millions de cellules (0,4 ml de bouillon de glutaraldéhyde à 25% + 9,6 ml de PBS). Glutaraldéhyde doit être utilisée fraîche. </li><li> Appuyez sur fond de tubes Falcon pour déloger pellets. Resuspendre culot cellulaire dans du glutaraldéhyde à 1%, en commençant par un petit volume pour éviter morceaux, puis compléter à plein volume. Mélanger par inversion. Crosslink pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur de bout en bout ou des rotateurs. </li><li> Arrêter la réaction de réticulation avec le volume de 1/10e de 1,25 M de glycine à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Centrifuger à 2000RCF pendant 5 min. Aspirer le surnageant et laver culot avec 20 ml refroidi PBS fois, tourne à 2000RCF pendant 5 min. </li><li> Aspirer et remettre en suspension le wcendré, réticulé culot avec 1 ml de PBS par réfrigéré 20 millions de cellules. Transférer chaque ml dans un tube Eppendorf et centrifuger à 2000RCF pendant 3 min à 4 ° C. Retirez autant que possible avec du PBS pointe de la pipette avec soin. </li><li> Flash geler les culots cellulaires dans l&#39;azote liquide et stocker à -80 ° C indéfiniment. </li></ol> 4. Lyse cellulaire Lyser les cellules réticulées à préparer un lysat cellulaire. <ol><li> Décongeler les culots de cellules congelés à température ambiante. Tapez difficile à déloger et mélanger le culot cellulaire. Isoler le culot à 2000RCF pendant 3 min à 4 ° C. Utilisez une forte pointe de la pipette 10 ul de supprimer tout reste PBS. </li><li> Sur une balance électronique (précision de 1 mg) la tare de la masse d&#39;un tube vide Eppendorf (nos tubes pèsent 1.060 grammes très régulièrement). Peser chaque pastille et enregistrer son poids. Un plat complet de 15 cm de cellules HeLa réticulés pèse généralement 100 mg. </li><li> Tampon de lyse Supplément (10X la masse de granulés de bois, par exemple 1 ml pour 100 mg) avec fresquesh Inhibiteur de la protéase, PMSF et Superase-in (voir la liste des tampons ci-jointe). Mélangez bien. </li><li> Ajouter 10X tampon de lyse du volume complété à chaque tube et remettre le culot. Pour de petites boulettes &lt;25 mg, remettre en suspension dans 250 ul de tampon de lyse complétée. La suspension doit être lisse. Si ce n&#39;est pas, il faut diviser la suspension en 500 aliquotes et utiliser un véhicule motorisé à granulés mélangeur pour briser les mottes. Procéder immédiatement à une sonication. </li></ol> 5. Sonication ADN cisaillement par sonication réticulés lysats cellulaires. <ol><li> Soniquer lysat cellulaire dans Bioruptor dans 15 ml tubes Falcon. Utilisation &lt;1,5 lysat ml dans chaque tube, et pour accélérer la sonication, sonication pas plus de deux tubes à la fois. </li><li> Soniquer dans un bain d&#39;eau à 4 ° C au réglage le plus élevé avec 30 secondes ON, 45 secondes OFF intervalles d&#39;impulsions. Vérifiez lysat toutes les 30 min. Continuer jusqu&#39;à ce que le traitement aux ultrasons lysat cellulaire est plus trouble. Cela peut prendre aussi peu que 30 minutes et jusqu&#39;à 4 heures. Le nombredes tubes, le volume d&#39;échantillon, la température du bain, et la période de temps de sonication se influer sur la durée du processus prend. Tubes sera probablement sonication à des taux différents, afin de les mettent en commun toutes les 30 min et de le redistribuer dans des tubes d&#39;origine pour assurer l&#39;homogénéité. Remarque: le glutaraldéhyde réticulé cellules prendre beaucoup plus de temps à sonication que leurs équivalents de formaldéhyde. </li><li> Lorsque lysat tourne clair, transférer 5 lysat ul dans un nouveau tube Eppendorf. Ajouter 90 uL d&#39;ADN protéase K (PK) de tampon (buffer voir la liste) et 5 PK ul. Vortex pour mélanger et centrifuger brièvement. Incuber pendant 45 min à 50 ° C. </li><li> Extraire l&#39;ADN avec le kit Qiagen PCR purification. ADN Eluer dans 30 uL tampon d&#39;élution Qiagen (EB) et vérifier la taille de l&#39;ADN sur gel d&#39;agarose 1%. Si en vrac du frottis d&#39;ADN est 100-500 pb, sonication est terminée. Si non, continuer à sonication. </li><li> Centrifuger les échantillons à soniqués 16100RCF pendant 10 min à 4 ° C. Combinez surnageants, aliquotes dans des échantillons de 1 mL et flash-gel dans nitroge liquiden. Conserver à -80 ° C. </li></ol> 6. CHIRP Hybrider des sondes d&#39;ADN à l&#39;ARN biotinylés et d&#39;isoler la chromatine liée. <ol><li> Décongeler complètement les tubes de la chromatine à la température ambiante. </li><li> Préparer un tampon d&#39;hybridation (voir la liste des tampons, de préparer 2 ml par ml de la chromatine). Vortex pour mélanger. </li><li> Pour un échantillon typique de CHIRP avec 1 ml de lysat, retirez 10 uL pour INPUT ARN et 10 uL d&#39;ADN pour INPUT et le lieu dans des tubes Eppendorf. Gardez sur la glace jusqu&#39;à ce une utilisation ultérieure. </li><li> Transférer 1 ml chromatine à 15 ml Falcon tube. Ajouter 2 ml de tampon d&#39;hybridation à chaque tube. Pour volume total &lt;1,5 ml, utiliser des tubes Eppendorf. </li><li> Décongeler sondes à température ambiante. Sondes Nanodrop pour vérifier le montant si vous ne l&#39;avez pas utilisé dans un temps long (100 uM sondes devraient spec ~ 500-600 ng / ul en utilisant unique paramètre brin d&#39;ADN). Ajouter le volume approprié de sondes dans des tubes spécifiques (100 pmol de sonde pour 1 ml de la chromatine, 1 ul de 100 pmol / ul sonde par 1 ml chromatine).Mélangez bien. Incuber à 37 ° C pendant 4 heures avec agitation. </li><li> Avec 20 min en restant pour l&#39;hybridation, préparer les perles C-1 magnétiques (conservé à 4 ° C). Utiliser 100 pi par 100 pmol de sondes. Laver avec 1 ml tampon de lyse sans complément trois fois, en utilisant la bande magnétique dynamag-2 à des billes distinctes de la mémoire tampon. </li><li> Remettre les billes en volume initial de tampon de lyse, supplément avec des produits frais PMSF, PI et Superase en. Après 4 h réaction d&#39;hybridation est terminée, ajouter 100 ul perles à chaque tube. Mélangez bien. Incuber à 37 ° C pendant 30 min avec agitation. </li><li> Préparer le tampon de lavage (5 ml par échantillon). Vortex pour mélanger. Préchauffer à 37 ° C. Ajouter PMSF avant utilisation. </li><li> Laver perles avec 1 ml de tampon de lavage cinq fois. Sur le premier lavage, utilisez dynamag-15 bande magnétique à des billes séparées, de décantation, et remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage. Transfert de volume à 1,5 ml tube Eppendorf. Incuber à 37 ° C avec agitation pendant 5 min. </li><li> Sur les lavages suivants, tourner en bas de chaque tube sur un minicentrifuge, Mis en échantillon sur dynamag-2 bande magnétique pendant 1 min. Décanter l&#39;échantillon, essuyer les gouttes avec un Kimwipe, remettre en suspension dans une solution de lavage ml. Incuber à 37 ° C avec agitation pendant 5 min. Répétez l&#39;opération pour cinq lavages au total. </li><li> Au dernier lavage, remettre en suspension les perles bien. Prélever 100 ul et mis de côté pour l&#39;isolement d&#39;ARN. Réserve 900 pi de la fraction d&#39;ADN. Placer tous les tubes sur dynamag-2 bande magnétique et éliminer le tampon de lavage. Spin tous les tubes vers le bas brièvement; les placer sur bande magnétique. Retirez le dernier bit du tampon de lavage complètement avec une forte pointe de la pipette 10 ul. </li></ol> 7. RNA Extrait fraction d&#39;ARN à partir d&#39;échantillons CHIRP pour quantifier par qRT-PCR. <ol><li> Prenez 100 ul d&#39;échantillons de perles et un échantillon de 10 ul ENTREE ARN. Ajouter 85 ul d&#39;ARN PK tampon pH 7,0 à l&#39;ARN de départ. Remettre les billes dans 95 ul d&#39;ARN 7,0 PK pH tampon. Ajouter 5 K Proteinease ul et incuber à 50 ° C pendant 45 min avec de bout en bout en secouant. </li><li> En bref spin down tous les tubes etfaire bouillir les échantillons pendant 10 min sur le bloc de chaleur à 95 ° C. </li><li> Réfrigérer les échantillons sur la glace, ajouter 500 ul TRIzol, homogénéiser vigoureusement au vortex pendant 10 secondes. Incuber à température ambiante pendant 10 min. Conserver à -80 ° C ou passez à l&#39;étape 4. </li><li> Ajouter 100 ul de chloroforme à TRIzol échantillons traités. Vortex vigoureusement pendant 10 sec. Centrifuger à 16100RCF sur une centrifugeuse de paillasse pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Retirer ~ 400 pi de surnageant aqueux, organique et en évitant l&#39;interface. </li><li> Ajouter 600 ul (1,5 volume) d&#39;éthanol à 100% et bien mélanger. Spin échantillon à travers MIRNeasy colonnes mini. Laver 1x avec RTT (MIRNeasy mini kit), 2x avec RPE selon le protocole du fabricant. Éluer avec 30 uL sans nucléase H 2 O (NFH 2 O). </li><li> Traiter l&#39;éluat ARN avec l&#39;ADN-libre par le protocole du fabricant. Après la réaction est terminée, chauffer l&#39;échantillon pendant 15 minutes à 65 ° C pour inactiver complètement toute restante DNase. </li><li> Utilisez 1 ARN ul par puits pour isoler qRT-PCR pour confirmer lncRNAextraction. GAPDH est souvent utilisé comme contrôle négatif. </li></ol> 8. Isolement d&#39;ADN Extrait fraction d&#39;ADN à partir d&#39;échantillons CHIRP à identifier par séquençage ou quantifier par qPCR. <ol><li> Préparer un tampon d&#39;élution d&#39;ADN (voir la liste des tampons), 150 ul par échantillon, y compris l&#39;entrée d&#39;ADN. </li><li> Ajouter 1 0μL RNase A (10 mg / ml) et 10 ul RNase H (10 U / pl) par ml de tampon d&#39;élution d&#39;ADN, et le vortex pour mélanger. </li><li> Remettre en suspension chaque échantillon de billes dans 150 pi de tampon d&#39;élution d&#39;ADN avec RNases. (INPUT ADN Resuspendre dans 140 uL) Incuber à 37 ° C pendant 30 min avec agitation. </li><li> Perles séparées et le surnageant sur dynamag-2 bande magnétique. Éliminer le surnageant et ajouter à tubes étiquetés. </li><li> Préparer une seconde partie aliquote de tampon d&#39;élution d&#39;ADN avec 10 uL Une RNase (10 mg / ml) et RNaseH (10 U / uL) exactement comme fait à la section 8.2). Ajouter 150 ul de chaque échantillon (y compris l&#39;entrée d&#39;ADN), incuber, et retirer le surnageant. Collectionnez-les tous surnageant (should être ~ 300 pi). </li><li> Ajouter 15 uL PK à chaque échantillon. Incuber à 50 ° C pendant 45 min avec agitation. </li><li> Pré-spin down jaune tubes de gel à verrouillage de phase (5PRIME). Transfert des échantillons d&#39;ADN dans les tubes de gel à verrouillage de phase, et ajouter 300 ul PhOH: chloroforme: isoamyle par échantillon. Agiter vigoureusement pendant 10 min, et centrifuger dans une centrifugeuse de paillasse à 16100RCF pendant 5 min à 4 ° C. Prenez aqueuse à partir du haut (~ 300 pi). Ajouter 3 GlycoBlue ul, 30 ul de NaOAc, et 900 ul EtOH 100%. Mélangez bien et conserver à -20 ° C pendant la nuit. </li><li> Spin échantillons à 16100RCF pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant avec précaution. Ajouter 1 ml EtOH 70% et le vortex pour mélanger. Centrifuger à 16100RCF pendant 5 min. Enlever le surnageant à la pipette. Sécher à l&#39;air pendant 1min. Remettre en suspension dans 30 pl EB. </li><li> Des échantillons d&#39;ADN sont prêtes pour l&#39;analyse par qPCR ou de la préparation des bibliothèques de séquençage à haut débit par le protocole d&#39;Illumina. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs Figure 1 </strong&gt; représente le flux de travail gazouiller. Une expérience réussie CHIRP enrichit généralement ARN cible de façon significative par rapport aux non-spécifiques des ARN. La figure 2 montre l&#39;enrichissement de la télomérase humaine ARN (TERC) à partir de cellules HeLa sur GAPDH, un ARN cellulaire abondant qui sert de contrôle négatif. La majorité des ARN TERC (~ 88%) présents dans la cellule ont été tiré vers le bas en effectuant CHIRP, alors que seulement 0,46% de la GAPDH ARN a été récupéré, ce qui démontre un facteur d&#39;enrichissement de ~ 200 fois. Sondes non spécifiques tels que des sondes ciblant l&#39;ARN LacZ, qui n&#39;est pas exprimé dans les cellules de mammifères (Figure 2), peut être utilisé comme d&#39;autres témoins négatifs. Des régions d&#39;ADN attendues pour lier le lncRNA cible sont généralement enrichies au cours régions négatifs lorsqu&#39;elle est mesurée par qPCR. La figure 3 montre la validation qPCR de quatre Hotair assortis sites dans des fibroblastes primaires de prépuce humain que nous avons déterminé en effectuant CHIRP-seq dans la même lignée cellulaire, tandis que TERC et GAPDH l&#39;ADN des sites soirve que les régions de contrôle négatif. Les deux «même» et «bizarre» la sonde fixe donné l&#39;enrichissement comparable attendus Hotair assortis sites sur les régions négatives, une caractéristique des véritables lncRNA sites de liaison. Séquençage à haut débit de l&#39;ADN enrichi CHIRP donne une carte mondiale des sites de liaison lncRNA. La drosophile lncRNA roX2 est connue pour interagir avec le chromosome X d&#39;une manière qui est nécessaire pour la compensation de dosage. La figure 4 montre le profil de liaison roX2 sur une section du chromosome X. Les deux &quot;même&quot; et &quot;impairs&quot; échantillons ont été séquencés et leurs bruits uniques ont été éliminés pour produire une piste de signaux qui se chevauchent. Chaque «pic» indique ici un site fort de roX2 contraignant. La piste complète et la liste des roX2 gènes cibles ont été décrits dans Chu et al. 2011 17. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Diagramme Figure 1. De la procédure CHIRPcédure. Chromatine est réticulée à lncRNA: adduits protéiques in vivo biotinylés sondes carrelage sont hybridées à cibler lncRNA et complexes chromatiniens sont purifiés en utilisant des billes de streptavidine magnétiques, suivie par des lavages strictes.. Nous éluer lncRNA ADN lié ou des protéines avec un cocktail de la RNase A et H. Une séquence lncRNA putatif de liaison est schématisée en orange. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Figure 2. Enrichit CHIRP pour l&#39;homme TERC ARN. TERC-asDNA sondes de récupérer environ 88% de l&#39;ARN cellulaire TERC et indétectable GAPDH. LacZ-asDNA sondes sont utilisés comme témoins négatifs et de récupérer ni ARN. Moyenne + sd sont présentés. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Figure 3. Hotair chirp-qPCR humaine primaire pourfibroblastes Eskin. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 et ABCA2 sont les régions qui interagissent avec Hotair. TERC et GAPDH ont servi de témoins négatifs. Moyenne + sd sont présentés. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Figure 4. CHIRP-seq de données de roX2 ARN dans les cellules de drosophile SL2. &quot;Même&quot; et &quot;bizarre&quot; ont été séquencés séparément; leurs données fusionnent pour ne tenir compte que des pics communs à la fois. La piste fusionnée est montré. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17.

<ol>
	<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes.">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li><li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNAs:+insights+into+functions.">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li><li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li><li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin.">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li><li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation.">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li><li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression.">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li><li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li><li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li><li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system.">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li><li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome,+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila.">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li><li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis.">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li><li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes.">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li><li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins:+yeast+telomerase+and+beyond.">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin.">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li><li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo.">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li><li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions.">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li></ol>

C. Chu et HY Chang sont nommés comme inventeurs sur une demande de brevet sur la base de cette méthode.

Ici, nous avons décrit CHIRP-seq, une méthode de cartographie des sites de liaison in vivo lncRNA l&#39;échelle du génome. Les paramètres clés de la réussite sont les piscines fendues de carrelage sondes oligonucléotidiques et de réticulation au glutaraldéhyde. La conception de sondes affinité est simple compte tenu de la séquence d&#39;ARN et ne nécessite aucune connaissance préalable de la structure de l&#39;ARN ou des domaines fonctionnels. Notre succès avec roX2, TERC, et Hotair - trois ARN assez différentes dans les deux espèces - suggère que CHIRP-seq est probable généralisables à de nombreux lncRNAs. Comme avec toutes les expériences, les contrôles de soins et de bonne sont tenus d&#39;interpréter les résultats. LncRNA différents peuvent nécessiter des conditions de titrage, et les changements judicieux de conditions, telles que la sélection de sondes d&#39;affinité différentes ou des agents de réticulation, peut mettre en évidence différents aspects de l&#39;ARN-chromatine interactions. Comme ChIP-seq, tous les événements de liaison ne sont pas nécessairement fonctionnelle, et des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les conséquences biologiques de l&#39;ARN occupancy sur la chromatine. Néanmoins, nous prévoyons de nombreuses applications intéressantes de cette technologie pour les chercheurs d&#39;autres chromatine associés lncRNAs, qui sont actuellement au nombre des milliers 8,9. Tout comme ChIP-seq a ouvert la porte à l&#39;échelle du génome des explorations de interactions ADN-protéines, chirp-études suivants de la &quot;interactome ARN&quot; peut révéler beaucoup de nouvelles avenues de la biologie.

Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20&deg;C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
10 mM EDTA 
1% SDS 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl 
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 
1 mM EDTA 
0.5% SDS 
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl 
1% SDS 
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
1 mM EDTA 
15% formamide (store in the dark at 4&deg;C) 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 
0.5% SDS 
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3 
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-10x10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized pellet mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>V8185-904</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase-in</td>
			<td>Ambion</td>
			<td><a href="http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>UCD-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (for sonication)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7626-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-01D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase H</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>R0601K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4875-100MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2302810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Ricca</td>
			<td>RSOC0020-1C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4057-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-027</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15515-026</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin isolation by rna purification (chirp)

ARN non codant longues sont des régulateurs clés de états de la chromatine pour des processus biologiques importants tels que la compensation de dosage, d&#39;impression, et l&#39;expression des gènes de développement 1,2,3,4,5,6,7. La découverte récente de milliers de lncRNAs en association avec des complexes spécifiques modification de la chromatine, comme complexe Polycomb répressive 2 (PRC2) qui assure la médiation histone H3 lysine 27 triméthylation (H3K27me3), suggère grands rôles pour de nombreuses lncRNAs dans la gestion des états de chromatine dans un gène spécifique la mode 8,9. Alors que certains sont lncRNAs pensé à travailler en cis sur les gènes voisins, d&#39;autres travaillent dans lncRNAs trans pour réguler les gènes situés loin. Par exemple, chez la drosophile lncRNAs roX1 et roX2 régions lient de nombreux sur le chromosome X des cellules mâles, et sont essentiels pour 10,11 compensation de dosage. Toutefois, les emplacements exacts de leurs sites de liaison ne sont pas connus à haute résolution. De même, l&#39;homme lncRNA Hotair peut affecter PRC2 d&#39;occupation sur les hes centaines de gènes du génome entier 3,12,13, mais comment la spécificité est atteint n&#39;est pas claire. LncRNAs peut également servir comme des échafaudages modulaires pour recruter l&#39;assemblage des complexes protéiques multiples. Le classique agissant en trans ARN échafaud est le TERC ARN qui sert de modèle et d&#39;échafaudage pour la télomérase complexe 14; Hotair peut aussi servir comme un échafaudage pour PRC2 et une déméthylase H3K4 complexe 13. Des études antérieures de cartographie d&#39;occupation ARN à la chromatine ont permis de mieux comprendre substantielles 15,16, mais seulement à un seul locus à la fois. Les sites d&#39;occupation de la plupart des lncRNAs ne sont pas connus, et les rôles de lncRNAs en matière de réglementation chromatine ont été la plupart du temps induite par les effets indirects de la perturbation lncRNA. Tout comme immunoprécipitation de la chromatine suivie par microarray ou séquençage en profondeur (ChIP-chip ou ChIP-seq, respectivement) a grandement amélioré notre compréhension des interactions protéine-ADN sur une échelle génomique, ici, nous illustrer un recenTLY publié stratégie pour cartographier l&#39;occupation à long génome à ARN à l&#39;échelle à haute résolution 17. Cette méthode, d&#39;isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP) (Figure 1), est basée sur la capture d&#39;affinité de la cible lncRNA: complexe de la chromatine par carrelage antisens-oligos, qui génère alors une carte de la génomique des sites de liaison à une résolution de plusieurs centaines de bases avec de sensibilité et d&#39;arrière-plan faible. CHIRP est applicable à de nombreux lncRNAs parce que la conception de sondes affinité est simple compte tenu de la séquence d&#39;ARN et ne nécessite aucune connaissance de la structure de l&#39;ARN ou des domaines fonctionnels.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

CHIRP est une nouvelle technique et rapide à la carte génomique des sites de liaison de l&#39;ARN non codantes de longues (lncRNAs). La méthode tire parti de la spécificité des oligonucléotides carrelage anti-sens pour permettre le dénombrement des sites génomiques lncRNA assortis.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

85.7K vues.  Stanford University School of Medicine. CHIRP est une nouvelle technique et rapide à la carte génomique des sites de liaison de l'ARN non codantes de longues (lncRNAs). La méthode tire parti de la spécificité des oligonucléotides carrelage anti-sens pour permettre le dénombrement des sites génomiques lncRNA assortis.

Vidéo: Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolement et caractérisation de l&#39;ARN-Contenant exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

Dans l&#39;endocytose hépatique in vivo suivie d&#39;une purification des cellules du foie par perfusion du foie

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Production et purification des droits de INO80 remodelage de la chromatine Complexes et Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Isolement de l&#39;ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...