Les auteurs remercient Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab et Marie Claire Pflimlin de la Roche et Tifany Schaer et Deborah Paolucci de HiQScreen pour leur assistance technique excellente.

Xenopus laevis sont logés et manipulés conformément aux lignes directrices Animal Canton de Genève.
1. radioligands
<ol><li>
Préparation de la plaque d’essai
	<ol>
<li>Préparer le 1,5 L de tampon avec 5 mM de KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl et 15 mM Tris ; ajuster le pH avec du HCl à 7,4.</li>
		<li>Préparer les composés à tester à 50,76 µM (par exemple, un composé à 10 mM dans un 980 µL de tampon de dosage dans un tube de microcentrifuge de 5 µL). Mélangez-les bien en utilisant une machine de vortex à grande vitesse pour 2 à 5 s.</li>
		<li>Préparer une dilution préalable de la flumazénil composé de référence en pipettant : 1 l de ce composé (10 mM) à 1 970 µL de tampon. Mélangez-les bien en utilisant une machine de vortex à grande vitesse pour 2 à 5 s.</li>
		<li>Diluer une solution mère de flumazénil [3H] avec le tampon à 4 ° C à 4 nM dans un tube en polypropylène 50 mL.</li>
		<li>Pipetter 50 µL/puits de tampon dans les colonnes 1 et 3-11 d’une microplaque 96 puits comme illustré dans le schéma représenté à la Figure 2.</li>
		<li>Pipetter 73,2 µL des composés dilués à 50,76 µM (voir étape 1.1.2) dans la colonne 12 de la plaque.</li>
		<li>Diluer chaque composé, à l’aide d’une progression géométrique sur 9 étapes (1E-10 – 1E–06 M), avec un volume de transfert µL 23,12 et le remplissage colonnes 3 – 11. Bien mélanger la dilution. Changer l’embout après chaque dilution.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluer les membranes cellulaires
	<ol>
<li>Décongeler les membranes des cellules déjà isolés d’un récepteur de GABAA humain sur-exprimant HEK293 (0,025 – 0,15 mg/mL) pour obtenir 80 mL à température ambiante (RT) et transférer la suspension dans le tampon à 4 ° C.</li>
		<li>Resuspendre la solution membrane encore à 4 ° C avec un homogénéisateur de tissu pour 30 – 40 s à 10 000 – 12 000 tr/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluer le diazépam pour le contrôle de la liaison non spécifique (NSB)
	<ol>
<li>Diluer une solution mère de diazépam de 4 mM avec le tampon à une concentration de 40 µM dans 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Commencer la réaction
	<ol>
<li>Distribuer 50 µL de 4 nM [3H] flumazénil dans chaque puits de la plaque à 96 puits et conservez-le dans un récipient d’eau glacée.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de la préparation de membranes de sous-type de récepteur GABAA pour avoir une teneur en protéine de 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Pipetter 50 µL de 40 diazépam µM dans la colonne 2.</li>
		<li>Incuber la plaque pendant 1 h sur la glace.</li>
		<li>Ajouter 50 µL de tampon dans chaque puits d’une plaque 96 puits filtre de séparation par membrane ultérieures et de mesure de la radioactivité et arrêter la réaction par la suite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Arrêter la réaction
	<ol>
<li>Préparer un tampon de lavage avec 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.</li>
		<li>Filtrer la solution avec une abatteuse de cellule de 96 puits. Laver la plaque 3 x avec 300 µL de tampon de lavage glacee / puits.</li>
		<li>Sceller la partie inférieure de la plaque avec un film plastique et ajouter 40 µL de cocktail pour liquide de scintillation scintillation comptant chacune bien et essuyez-le avec de l’éthanol 70 %.</li>
		<li>Secouez légèrement la plaque pendant au moins 1 h à température ambiante. Laissez reposer pendant au moins une heure à température ambiante.</li>
		<li>Mesurer la radioactivité (en CPM) en plaçant la plaque sur un compteur à scintillation. Permettre une mesure pendant 3 min / puits.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse des données
	<ol>
<li>Déterminer que la moyenne pour les 8 réplique de liaison non spécifique (NSB) et de la fixation totale (CT) aussi bien en ce qui concerne les doublons ou réanalysés des échantillons. Calculer la % de fixation spécifique (SB) pour la moyenne de l’échantillon selon l’équation suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Ici, total SB = la moyenne to moins le moyen les ONN.</li>
		<li>Terrain en abscisse le SB % versus en ordonnée les concentrations de l’inhibiteur. Ajuster les données à l’aide de l’équation d’analyse de concurrence site unique : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Ici, y = le % de SB, A = le minimum y, B = la valeur maximale y, C = la ci50, X = le journal10 de la concentration du composé concurrente, D = pente de la courbe (un coefficient de Hill).</li>
		<li>Calculer l’affinité (Ki) en utilisant la moitié de la concentration inhibitrice maximale (IC50), la constante de dissociation (Kd) de flumazénil [3H] sur les membranes respectives9et la concentration de la [3H] flumazénil dans le dosage selon l’équation suivante à l’aide de données : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enregistrements dans des ovocytes de Xenopus et Expression du récepteur
<ol><li>Ovaires récolte et préparation des ovocytes
	<ol>
<li>Préparer la solution stérile de Barth avec 88 mM NaCl, KCl 1 mM, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O et 0,41 mM CaCl2.6H2O, à pH 7,4 , additionné de 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 µg/mL d’amphotéricine b.</li>
		<li>Préparer le milieu de x OR2 1 (aucun CaCl2) avec 88,5 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, à un pH de 7,4.</li>
		<li>Sacrifice une Xenopus Laevis femelle par une anesthésie profonde pendant 20 min en refroidi méthanesulfonate de tricaïne (à une concentration de 150 mg/L, ajusté à pH 7,4) et bicarbonate de sodium (300 mg/L) suivie par décapitation.</li>
		<li>Récolter les ovaires rapidement avec des ciseaux propres et forceps et placez-les dans 2 plats de Pétri (10 cm) contenant 40 mL de 1 x solution de Barth et antibiotiques/antimycosiques.</li>
		<li>Stocker les ovaires non dissociées jusqu'à 2 semaines dans une solution Barth à 4 ° C.</li>
		<li>Pour la dissociation, couper les ovaires avec une lame de rasoir propre en petites fractions (1 – 2 cm3) et incuber eux dans 50 mL d’OR2 moyen sans CaCl2 (OR2-noCaCl2) contenant 0,2 % collagénase (Type I) à 17 et 19 ° C dans un cône de 100 mL fiole avec une agitation lente pendant 4 à 5 h. vérifier que le barreau magnétique est placée environ 3 à 5 cm au-dessus du fond de la fiole de spinner pour ne pas écraser les ovocytes.</li>
		<li>Après 4-5 h, vérifier que la plupart des ovocytes est libérée de leur follicule (c.-à-d., ils nagent individuellement). Laver 5 x 200 ml d’OR2 additionné de 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Transférer la defolliculated ovocytes à boîtes de Pétri (10 cm) rempli de solution de Barth et antibiotiques/antimycotiques et garder au moins une nuit à 17 ° C avant l’injection d’ADNc ou ADN messagère.</li>
		<li>Le jour suivant, sélectionnez cette option, au titre de jumelles, un ovocyte en bonne santé présentant une claire et distincte animaux contre un poteau de vegetal (brun foncé pour le pôle animal contre jaune clair pour le pôle végétal). Utiliser des pipettes Pasteur propres et jeter les ovocytes un par un dans une plaque de puits 96-injection conique stérile. NOTE : Aucun soin particulier n’est nécessaire dans le placement des ovocytes pour les injections de l’ARNm ; considérant que, pour les injections de l’ARNC, il est indispensable d’orienter les ovocytes avec le pôle animal vers le haut.</li>
	</ol></li>
	<li>ARNm ou cDNA injection automatique
	<ol>
<li>Synthétiser les ARNm à l’aide d’un kit disponible dans le commerce en suivant les instructions recommandées. Nettoyer les instruments et la table avec de la RNase et porter des gants de protection appropriés. NOTE : La qualité de l’ARNm est déterminant pour obtenir une bonne expression, et il est indispensable de prévenir la dégradation de l’ARNm lors de la procédure d’injection.</li>
		<li>Préparer à l’aide d’un kit disponible dans le commerce des ADNc et dissoudre la quantité désirée dans l’eau Watercooling à une concentration de 0,2 µg/µL.</li>
		<li>Injecter 10 à 50 nL de solution d’ARNm à une concentration de 0,2 nL µg/µL ou 10 de cDNA de solution à une concentration allant de 0,02 à 0,2 µg/µL, de préférence en lots de 95 ovocytes.</li>
		<li>Pour membrane protéines nécessitant plusieurs sous-unités (c.-à-d., les récepteurs de GABAA α1β2γ2 hétéromérique), mélangez l’ADNc du ratio désiré ARNm correspondants (p. ex., 1:1:1 ou 1 / 10:1).</li>
		<li>Maintenir l’ovocyte à 17 ° C pour empêcher l’expression des protéines de choc thermique par les ovocytes ; stocker la microplaque dans un espace de rangement thermo-contrôlée.</li>
		<li>Dissoudre les composés d’essai qui ont été testés positifs dans le test de liaison chez OR2 à 0,1 – 1 000 µM pour les enregistrements électrophysiologiques et les éliminer dans une plaque en polypropylène à fond plat de 96 puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmides pour l’expression
	<ol>
<li>Suivre les notices des kits disponibles dans le commerce pour la synthèse de l’ARNm avec des promoteurs T7 ou T6 bactériennes et faire 20 µL d’une solution à 0,2 µg/µL en eau exempte de RNase.</li>
		<li>Préparer au moins 20 µL d’une solution contenant un vecteur d’expression eucaryote pour l’expression de la cDNA, généralement à 0,2 µg/µL, dissous dans l’eau Watercooling.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection dans l’ovocyte et la visualisation de sa qualité
	<ol>
<li>Injecter 10 à 50 nL de la solution contenant le plasmide (voir étape 2.3.1 ou 2.3.2) à l’aide d’une aiguille de la micro-injection de verre avec un diamètre allant jusqu'à 100 µm monté sur un micromanipulateur équipé d’un système d’éjection de pression ou avec un système à injection automatisée. Remarque : Dans l’exemple abordé ici, les ovocytes sont injectées par lots de 95 avec un système automatisé conçu pour fonctionner avec les ADNc ou ADN messagère.</li>
		<li>Remplir l’aiguille d’injection de 1 µL d’un colorant comme le bleu de méthylène à 1 % et injecter les ovocytes à l’aide de la procédure standard (que ce soit dans le noyau de cDNA ou dans le cytoplasme de l’ARNm).</li>
		<li>Disposer les ovocytes injectés pendant environ 1 min dans l’eau bouillante. Couper les ovocytes en deux avec une lame de rasoir sous les jumelles. Remarque : Le colorant soit localisé, comme illustré à la Figure 3E, ce qui permet une observation précise de l’injection.</li>
	</ol></li>
	<li>Enregistrements de deux électrodes de voltage clamp
	<ol>
<li>Placer la plaque bien contenant les ovocytes sur l’automatisme, qui utilise le principe illustré à la Figure 4. Remarque : À la différence du système à pince patch illustré à la Figure 5, le potentiel vrai de membrane de la cellule est lu par l’électrode tension.</li>
		<li>Programmer le système d’enregistrement automatisé à l’aide de l’interface à base d’icônes avec, par exemple, le schéma illustré à la Figure 6 pour la détermination de la relation de l’activité de concentration.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajustement de courbe
	<ol>
<li>Analyser les résultats en utilisant le logiciel approprié, à l’aide de la courbe d’activation concentration illustré, tracer l’amplitude du courant en fonction du logarithme de la concentration d’agoniste.</li>
		<li>Vous pouvez observer la courbe sigmoïde qui peut être équipée ultérieurement l’équation empirique de la colline sous la forme : <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Ici, Y= la fraction du courant évoqué, EC 50 = la concentration pour une activation de 50 %, x = la concentration du composé, nH = le coefficient de Hill ou la coopérativité apparente.</li>
		<li>Normaliser les courants à une unité en divisant l’amplitude de chaque réponse par rapport à la valeur enregistrée la plus forte concentration d’analyser les données obtenues à partir d’une série de cellules.</li>
		<li>Déterminer la moyenne et les écarts-types et se rendre compte de l’ajustement de la courbe à l’aide de logiciels disponibles de façon standard.</li>
	</ol></li>
</ol>3. électrophysiologiques enregistrements dans des tranches de cerveau
NOTE : Les tranches d’hippocampe de rat sont préparés conformément aux directives nationales et institutionnelles.
<ol><li>
Préparation de tranches de l’hippocampe
	<ol>
<li>Préparer la dissection artificiel céphalo-rachidien (dACSF) avec 124 mM 124 de NaCl, KCl 2,5 mM, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM de glucose et 4 mM saccharose, gazé dans la bouteille avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2.</li>
		<li>Préparer l’enregistrement artificiel céphalo-rachidien (rACSF) avec 124 mM NaCl, KCl 5 mM, 1.25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3et 10 mM de glucose gazés dans la bouteille avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2.</li>
		<li>Anesthésier les rats à l’aide d’un mélange de 2,5 % isoflurane et de l’oxygène pur et les décapiter.</li>
		<li>Couper le cuir chevelu, suit la ligne médiane avec une belle paire de ciseaux. Couper le crâne le long de la ligne médiane sans endommager les tissus sous-jacents. Retirez le crâne avec des pincettes et utilisez une spatule fine pour évider le cerveau.</li>
		<li>Placer le cerveau dans la solution de dACSF gazés à RT et disséquer la formation hippocampique gauche avec une spatule fine.</li>
		<li>Couper en tranches transversales (400 µm d’épaisseur) de la partie moyenne de l’hippocampe avec un hachoir de tissus et de les transférer à la chambre d’enregistrement à l’aide d’une brosse de peinture. Maintenir les tranches à ta pendant 45 min.</li>
		<li>Perfuse les tranches avec le rACSF gazé à 35 ° C et à un taux de 1,5 mL/min. de la bulle la solution avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2. NOTE : Après cette étape, les tranches sont prêtes pour les expériences électrophysiologiques.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enregistrement de spike seule population
	<ol>
<li>Déposer une tranche de cerveau dans la chambre de microscope-monté.</li>
		<li>Perfuse la tranche à raison de 3 mL/min avec rACSF.</li>
		<li>Tirez une micropipette de verre borosilicaté avec l’extracteur de pipette ayant une résistance de ~ 2 MΩ. Remarque : Cette micropipette est utilisée comme une électrode d’enregistrement et est électriquement raccordée à l’amplificateur.</li>
		<li>Remplissez la micropipette avec une solution contenant 2 M NaCl et placez-le dans le porte-pipette de l’amplificateur.</li>
		<li>Position la micropipette d’enregistrement dans la strate pyramidale dans la région CA1 de l’hippocampe tranche en utilisant le micromanipulateur droit. Remarque : L’emplacement est schématiquement représenté à la Figure 7.</li>
		<li>Placez une électrode bipolaire isolé de platine/iridium dans la porte sur la gauche micromanipulateur. Remarque : Cette électrode est utilisée comme l’électrode de stimulation et est reliée électriquement au générateur de stimulus.</li>
		<li>Positionner l’électrode de stimulation dans les collatérales de Schaffer dans la région CA1 de l’hippocampe tranche en utilisant le micromanipulateur droit. Remarque : L’emplacement est schématiquement représenté à la Figure 7.</li>
		<li>Fournir une impulsion de courant à l’électrode de stimulation à l’aide du générateur d’impulsion toutes les 30 s (durées de 100 µs, à partir de 10 µA) et d’augmenter progressivement l’intensité de stimulation jusqu'à ce qu’apparaisse un pic de population (PS).</li>
		<li>Régler la puissance de stimulation pour évoquer un PS correspondant à 45 % de l’amplitude maximale qui peut être obtenue. PSs sont filtrés à 2,4 KHz et numérisés à 20 KHz à l’aide de l’amplificateur de signal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inhibition d’impulsions pairées
	<ol>
<li>Préparer les tranches de cerveau (étape 3.1) et procédez comme décrit précédemment (pas 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Fournir deux impulsions de courant (100 µs durées à un intervalle de 20 ms) à l’électrode de stimulation, toutes les 30 s en utilisant le générateur d’impulsion. Régler l’intensité de stimulation pour évoquer un PS correspondant à 45 % de l’amplitude maximale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Composé de tests
	<ol>
<li>Préparer des dilutions des composés qui seront essayés dans le FSCA gazé afin que la concentration finale de DMSO non supérieure à 0,1 %.</li>
		<li>Ajouter DMSO à la solution de contrôle à la même concentration que dans le composé en solution.</li>
		<li>Enregistrer un single (étape 3.2) ou un jumelé-pulse (étape 3.3) ch évoquée par les stimulations collatérales de Schaffer toutes les 30 s pendant au moins 30 min. La forme du PS doit être stable pendant cette période de référence.</li>
		<li>Préparer un bécher avec gazés rACSF contenant une concentration fixe de la substance à tester.</li>
		<li>Perfuse l’hippocampe tranche avec cette solution alors qu’il enregistrait encore le PS seul ou impulsions pairées.</li>
		<li>Évaluer la récupération de l’effet composé en perfusant la tranche de pain avec rACSF gazé sans le composé. Remarque : Pour les effets réversibles, le PS revient à sa forme initiale observée au cours de la période de base avant l’application de composés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse des données
	<ol>
<li>Moyenne les traces du PS enregistrement au cours de l’expérience dans des blocs de 4 en utilisant le logiciel d’analyse de données.</li>
		<li>Mesurer les amplitudes PS des traces en moyenne.</li>
		<li>Normaliser les amplitudes en pourcentage des valeurs de base enregistrées 10 min avant la perfusion d’un composé.</li>
		<li>Exprimer les données en moyenne ± SEM</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

Les auteurs Frédéric Knoflach et Maria-Clemencia Hernandez sont des employés de F. Hoffmann-La Roche AG, Bâle, 4070, une société pharmaceutique. L’auteur Daniel Bertrand est un employé de HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genève (Suisse), la fourniture d’installations de criblage aux compagnies pharmaceutiques.

Le développement de nouveaux composés actifs à un canal d’ion de ligand-dépendants tels que les récepteurs GABAA nécessite l’utilisation d’approches multiples. En règle générale, la première étape est souvent réalisée à l’aide d’essais de liaison ; Toutefois, ces mesures ne suffisent pas à caractériser l’activité physiologique de l’enceinte ou sa pharmacologie précis. En particulier, un composé qui se lie à un récepteur peut améliorer ou inhiber sa fonction ou même ne produire aucun effet fonctionnel (se taire) (c.-à-d., liaison au récepteur sans modifier sa fonction). Ainsi, un test fonctionnel est nécessaire pour une caractérisation complète composée.
Tests de liaison: Le principal avantage de l’essai de liaison est qu’il peut être mené efficacement sur un grand nombre d’échantillons allant jusqu'à plusieurs milliers, et qu’elle fournit les affinités de liaison pour les molécules actives. Tel que décrit ci-dessus, la première étape consiste à établir une méthode pour l’évaluation des sous-types de récepteurs désirée. Nommément, tandis que la liaison peut être effectuée sur des récepteurs natifs de fractions ou de cerveau entier, une telle méthode permettra d’éviter la détermination des affinités aux sous-types de récepteurs spécifiques. Par conséquent, il est nécessaire d’utiliser des systèmes recombinantes à des molécules de l’écran à la cible souhaitée. De nos jours, une transfection transitoire ou stable des ADNc sous-unité récepteur désiré dans les lignées cellulaires propose une méthode efficace et fiable pour exprimer les sous-types de récepteurs d’intérêt (p. ex., GABAA α5β3γ2). Liaison traditionnelle faire des essais sur l’utilisation de radioligands, mais de nos jours, les techniques sont disponibles qui éviter l’inconvénient de manipulation radioactivité (p. ex., quantitatifs basés sur la fluorescence ligands).
Expression fonctionnelle dans un système hôte : Pour exprimer les gènes dans un système hôte, la séquence codante d’intérêt doit être insérée dans un plasmide contenant les promoteurs adéquates. En général, pour in vitro le synthèse des ARNm, les promoteurs T7 ou T6 bactériennes sont utilisés. Pour une expression de cDNA, la transcription du gène d’intérêt doit être réglementée par un promoteur eucaryote comme CMV (cytomégalovirus) ou l’équivalent. De nos jours, plusieurs plasmides, y compris les deux promoteurs(p. ex., pUNIV, CMVp-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), sont disponibles permettant une synthèse in vitro des ARNm ou une expression de cDNA, comme illustré à la Figure 15. Obtient une expression des récepteurs GABAA peut être fidèlement dans des lignées cellulaires ou dans des ovocytes de Xenopus . Les principaux avantages de ce dernier sont l’absence d’une expression de récepteurs endogènes, la simplicité des manipulations et la disponibilité d’un système automatisé pour micro-les injections et les enregistrements. Les procédures décrites dans le présent protocole illustrent l’efficacité de l’automatisme, qui permet l’injection de 96 ovocytes en 7 min et ne nécessite aucune connaissance en micromanipulation. Se souvenant qu’un seul ovaire d’une Xenopus contienne entre 10 000-30 000 ovocytes, il est clair qu’un grand nombre de mesures de la cellule peut être effectué sur une seule préparation. En outre, comme une expression peut être effectuée en utilisant des injections de l’ARNC, les mêmes plasmides contenant les gènes d’intérêt qui sont développés pour les expériences de liaison peuvent être utilisés pour une caractérisation fonctionnelle sans devoir encore la biologie moléculaire manipulations.
Compte tenu de sa grande taille et haute expression superficielle, un seul ovocyte donne un nombre de récepteurs qui correspond approximativement aux cellules confluentes dans une boîte de Pétri de 35 mm. Cependant, une préparation des ovocytes et injection représente une fraction du coût d’une lignée de cellules, comme les expériences ne nécessitent pas un milieu de culture spécifique et manipulations stériles. L’activation d’un seul canal de GABAA donne quelques picoamperes (10-12) et des courants allant jusqu'à des dizaines de microampère (10-6) sont facilement enregistrées dans un seul ovocyte, qui confirme l’activité concomitante de plusieurs millions de récepteurs au cours d’une seule réponse.
Une première étape dans la caractérisation des canaux ioniques ligand-dépendants est souvent la détermination de l’affinité apparente des récepteurs. Les expériences qui doivent être réalisée consistant en appliquant une série d’impulsions d’essai bref agoniste et l’amplitude de l’évoqués actuel ou, dans certains cas, l’aire sous la courbe (AUC) en fonction du logarithme de la concentration d’agoniste de traçage. Comme il est facilement possible de microinject des concentrations différentes de plasmide et ratio dans le même lot d’ovocytes, ce système d’expression est particulièrement approprié pour une telle qualification. En outre, une comparaison de lot a révélé un degré élevé de stabilité des différents EC50s. L’influence de la composition de la sous-unité sur l’affinité apparente du récepteur est facilement visualisé à l’aide d’un complot de l’araignée, comme illustré à la Figure 10.
Les résultats de la pince de tension deux électrodes obtenus dans des ovocytes de Xenopus sont souvent comparés avec les enregistrements réalisés à l’aide d’électrodes de patch clamp. Considérant qu’il irait au-delà de la portée de ce travail d’entrer dans une comparaison détaillée entre ces deux systèmes, quelques points peuvent être examiné. Même si un patch clamp de cellules offre des avantages pour une caractérisation biophysique avec une demande de drogue rapide, ses exigences sont plus complexes que celles des enregistrements deux électrodes dans des ovocytes de Xenopus . Une difficulté première et non négligeable est l’expression d’une protéine donnée avec la nécessité d’une culture de cellules, une transitoire ou transfection stable et l’identification des cellules qui expriment la construction désirée. En outre, il est indispensable d’examiner la contribution possible de l’expression endogène dans la cellule considérée. En outre, un enregistrement de patch clamp exige qu’une personne qualifiée mener la micromanipulation sous un microscope à fort grossissement, alors que cette personne doit aussi effectuer une analyse adéquate pendant l’expérience pour évaluer, par exemple, la qualité du joint, la résistance d’accès etc. , en revanche, une pince de tension deux électrodes d’enregistrement, en particulier un à l’aide d’un système automatisé électrophysiologique, ne nécessite aucune compétence spécifique et peut être effectuée par des techniciens de laboratoire.
Lors de l’acquisition d’un set-up électrophysiologique, considération de coût est certainement un facteur important qui doit être soigneusement analysée. Par exemple, alors que le coût d’un système automatisé est relativement élevé, une comparaison plus étroite révèle que l’installation d’une plate-forme complète d’électrophysiologique comprend l’achat d’équipement tels que des micromanipulateurs bonnes, une lentille binoculaire, un amplificateur, une perfusion système et une table antivibratoire, tout en acquisition de données et en effectuant une analyse. Une comparaison des coûts entre un deux électrodes de voltage clamp Set-up contre un set-up de la pince patch révèle des écarts encore plus loin. En outre, le système automatisé offre l’avantage d’un équipement entièrement automatisé et fonctionne sans surveillance jour et nuit.
Les propriétés pharmacologiques d’un composé sont déterminées par son mode d’action au niveau du récepteur. Par exemple, des inhibiteurs compétitifs sont des molécules qui peuvent entrer dans la même poche de liaison, ou le site orthosteric, que l’agoniste elle-même provoque une compétition. Inhibiteurs non compétitifs sont des composés qui inhibent les récepteurs en interagissant sur un autre site et, dans le cas d’un canal de ligand-gated ion, qui peuvent entrer et bloquer le pore ionique, par exemple. Il irait au-delà de la portée de ce travail afin d’examiner les différents mécanismes d’interaction, mais des informations complémentaires peuvent être obtenues d’un manuel pharmacologique et/ou d’autres travaux tels que Bertrand et Bertrand22.
Dans le cas de MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES, le composé lie à un site qui se distingue de la site d’orthosteric, mais la présence de la molécule modifie la barrière d’énergie entre les États de l’actifs et d’autres. MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs (PAMs) sont des composés qui réduisent la barrière d’énergie de la mise au repos à l’état actif et, par conséquent, augmentent l’effet de l’agoniste. Afin de caractériser les effets possibles de PAM, il faut, par conséquent déterminer si une exposition à la substance améliore la réponse à l’agoniste et, si oui, à quelle concentration. Les expériences présentées dans la Figure 11 et Figure 14 illustrent les protocoles qui peuvent être utilisés avec succès pour la caractérisation des PAMs les récepteurs GABAA .
Dans certains cas, l’exposition à la PAM seule pourrait suffire à activer les récepteurs. Cette activité peut être déterminée par une légère modification du protocole expérimental présenté ici. À savoir, au lieu d’utiliser une application conjointe du modulateur lors de l’exposition à la GABA, le protocole peut être modifié pour l’application du premier composé seul, puis en présence de la GABA. Une caractérisation de l’activité agoniste direct se fera par la détermination de l’amplitude de la réponse évoquée par le camp lui-même et par rapport au courant induite par le GABA.
Des expériences réalisées dans des tranches de cerveau, comme illustré à la Figure 7, sont utilisés pour confirmer l’activité composée au niveau des récepteurs natifs dans un circuit inhibiteur définitif avant d’aller plus loin dans des modèles animaux et le long de la voie vers des essais cliniques. Le protocole d’enregistrement et d’analyse de données relativement simple permet le classement des composés multiples en évaluant leur effet modulatrice différentiel sur l’amplitude du PS. Effets non spécifiques des composés qui ne sont pas liées au système GABA peuvent également être détecté (par exemple, lorsqu’on observe des changements dans la forme de PS). Direct, neurotransmission GABAergique peut être évaluée dans ces cas en mesurant les effets des composés sur des courants postsynaptiques inhibitrices (CISP) à l’aide de la cellule entière patch clamp technique8.

Nous présentons ici les protocoles pour la découverte de composés actifs au niveau des récepteurs GABAA , de la liaison à la physiologie et de pharmacologie. Dans la recherche de nouvelles molécules spécifiques des récepteurs GABAA , il est crucial de définir, aussi précisément que possible, le sous-type d’intérêt et de l’évaluation de la spécificité des composés nouvellement identifiés (par exemple, pour un compte-rendu, voir Rudolph et Knoflach1ou Sieghart2). Chemin d’accès standard dans la découverte et les mesures qui doivent être atteints sont illustrées à la Figure 1.
Essais de liaison ont été et sont encore largement utilisés comme la première étape dans la découverte de médicaments. Dans le cas des récepteurs GABAA , ils sont optimisés afin d’identifier les composés qui se lient à l’accepteur benzodiazépine du récepteur où lient thérapeutiquement utiles et sécuritaire des médicaments. Autres techniques, utilisant fluorimétrique imagerie plaque lecteur (FLIPR) membrane potentiels des essais teintée rouge3, détectent des composés comme les barbituriques qui se lient à des sites supplémentaires qui sont moins souhaitables en raison de leur profil d’effets secondaires indésirable. En outre, les colorants utilisés peuvent activer directement les récepteurs GABAA , questionnant ainsi l’utilité de ces essais pour la drogue découverte4. Tests de liaison ne peut fournir la preuve qu’une substance donnée peut se lier à une classe de récepteurs spécifiques. In vitro essais avec les membranes cellulaires sont utilisés pour identifier les sélectifs humaines ligands des récepteurs GABAA α5β3γ2. Les cellules HEK293 transitoirement transfectées exprimant l’humain GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 et α3β3γ2 récepteurs servent à préparer des membranes de ces tests. L’effet des ligands est détectée en mesurant la scintillation de flumazénil [3H] lié aux récepteurs membranaires (une inhibition de la liaison de flumazénil [3H]). Le principal avantage de cette technique est qu’une décision rapide et efficace de l’affinité de liaison composé au récepteur d’intérêt est fournie au récepteur d’intérêt.
Des études fonctionnelles sont essentiels pour évaluer l’activité fonctionnelle des composés et de proposer une explication physiologique et pharmacologique des mécanismes causée par la liaison des composés aux récepteurs. Aujourd'hui, c’est bien connu que les récepteurs GABAA fonctionnels résultent de l’assemblage de cinq sous-unités autour d’un axe de pseudosymmetry formé par le pore ionique et le résultat de l’assemblage de cinq sous-unités identiques. La plupart des récepteurs GABAA est composée de deux ou plusieurs sous-unités différentes. Le récepteur GABAA majeur du cerveau, par exemple, se compose des sous-unités α1, β2 et γ2 dans une stoechiométrie de 2, 2 et 1 respectivement5,6. Une reconstitution dans un système hôte tels que les ovocytes de Xenopus laevis ou cellules HEK293 offre la possibilité de découvrir rapidement les propriétés pharmacologiques des récepteurs.
Les propriétés pharmacologiques des composés sont ensuite explorées avec des enregistrements extracellulaires de tranches de cerveau7. Cette méthode permet une exploration de l’effet des composés sur la neurotransmission et fournit un moyen efficace pour confirmer les effets fonctionnels des composés déterminés dans des systèmes d’expression hétérologue au niveau des récepteurs natifs dans l’ensemble environnement neuronal. Neurotransmission GABAergique peut aussi être évaluée au niveau moléculaire en mesurant les effets des composés courants postsynaptiques inhibitrice (CISP)8. Mais le protocole utilisé ici et basées sur des enregistrements de serrage patch germes entiers dans des tranches de cerveau est plus élaboré et conduit à un débit inférieur.
Enfin, les forces et les faiblesses de l' in vitro screening cascade utilisé pour l’identification de ligands sélectifs α5β3γ2 sont examinées dans la perspective des différentes techniques et leurs limites intrinsèques. Ce travail devrait fournir des experts et non experts dans le domaine des récepteurs GABAA un examen utile de l’ensemble des différentes in vitro des approches permettant de s’attaquer à la découverte de nouveaux modulateurs de ces canaux ligand-gated ion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Cette présente manuscrit un protocole étape par étape pour le dépistage des composés à gamma-aminobutyrique acide type un récepteurs (GABA-A) et son utilisation vers l’identification de nouvelles molécules actives dans les essais précliniques d’une recombinaison in vitro récepteur à leurs effets pharmacologiques au niveau des récepteurs indigènes dans des tranches de cerveau de rongeurs. Pour les composés obligatoire sur le site de benzodiazépine du récepteur, la première étape consiste à mettre en place un écran primaire qui consiste à développer des radioligands essais de liaison sur les membranes cellulaires exprimant les principaux sous-types de GABAA . Puis, profitant de l’expression hétérologue des récepteurs de GABAA rongeurs et humains dans les ovocytes de Xenopus laevis ou cellules HEK 293, il est possible d’explorer, dans des tests électrophysiologiques, les propriétés physiologiques des différents récepteurs sous-types et les propriétés pharmacologiques des composés identifiés. Le système d’ovocytes Xenopus est présenté ici, commencer par isoler les ovocytes et leur microinjection avec différents ARNm, jusqu'à la caractérisation pharmacologique à l’aide de pinces de tension de deux électrodes. Enfin, enregistrements effectués dans des tranches de cerveau rongeurs seront décrites qui sont utilisés comme un test physiologique secondaire pour évaluer l’activité de molécules à leurs récepteurs natifs dans un circuit neuronal bien défini. Enregistrements extracellulaires en utilisant les réactions des populations de neurones multiples sont démontrés avec la demande de drogues.

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Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Nous présentons ici les protocoles visant à découvrir des composés actifs au niveau des récepteurs GABAA , de la liaison à la physiologie et de pharmacologie.

Méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide Gamma - aminobutyrique tapez une Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

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13.4K vues.  Roche Innovation Center Basel. Nous présentons ici les protocoles visant à découvrir des composés actifs au niveau des récepteurs GABAA , de la liaison à la physiologie et de pharmacologie.

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Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

Appareil et méthode pour Novel Drug Renforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Recherche

Neurosciences

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Application d&#39;une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection paires et test d&#39;électrophysiologie à l&#39;écran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Les méthodes de l&#39;administration par voie intraveineuse auto dans un modèle de souris

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Haute résolution magnétique fonctionnelle Méthodes d&#39;imagerie par résonance mésencéphale humain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Méthodes pour étudier les mécanismes d&#39;action des antipsychotiques dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Contrôle optique d&#39;une protéine Neuronal L&#39;utilisation d&#39;un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

Établir un modèle de souris d’une neuropathie Pure petites fibres avec l’agoniste Ultrapotent de Transient Receptor potentiels Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Roman passif méthodes de compensation pour la Production rapide de transparence optique dans tout le tissu CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...