Le but de notre recherche est de développer une nouvelle méthode in vitro pour l’évaluation rapide et sensible de la toxicité et de l’écotoxicité des polluants basée sur l’évaluation de la motilité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis en tant qu’organisme modèle. Les méthodes basées sur les effets, telles que les essais biologiques in vitro et in vivo, représentent des outils innovants pour détecter les effets des polluants chimiques environnementaux sur les organismes vivants. Ces méthodes peuvent servir d’outils pour la biosurveillance environnementale et l’évaluation des risques.
Cette recherche comble une lacune importante en toxicologie en mettant l’accent sur l’utilisation de la motilité des hémocytes comme nouveau paramètre pour évaluer l’effet des polluants sur les moules. Bien que la motilité des hémocytes soit cruciale pour les réponses immunitaires, sa sensibilité à l’exposition aux polluants est sous-étudiée chez les bivalves. Nos résultats font progresser la recherche en toxicologie et en écotoxicologie de plusieurs façons.
En offrant un nouveau paramètre pour le dépistage de la toxicité, en soutenant la recherche éthique en minimisant les essais sur les vertébrés et en faisant progresser l’applicabilité en écotoxicologie. Cette approche peut avoir une large application dans la biosurveillance environnementale et pourrait être adaptée à d’autres cellules immunitaires en écotoxicologie. Pour commencer, pré-remplissez une seringue avec 0,5 millilitre de solution saline physiologique standard tempérée à 15 degrés Celsius.
Positionner le spécimen de moule adulte acclimaté pour la collection d’hémolymphe. À l’aide d’un scalpel, séparez légèrement et soigneusement les valves le long de la surface ventrale. Maintenez le scalpel en position ou utilisez une pointe de pipette pour garder l’espace ouvert.
Ensuite, insérez l’aiguille d’une seringue hypodermique dans l’espace entre les valves. Prélevez doucement 0,5 millilitre d’hémolymphe du muscle adducteur postérieur à l’aide de la seringue préremplie. Maintenant, retirez l’aiguille de la seringue et transférez le contenu de la seringue dans un microtube.
Regroupez les échantillons prélevés sur trois ou quatre moules dans un tube en maintenant la température de 15 degrés Celsius. Après avoir évalué la viabilité des hémocytes, pour les cultiver, ajoutez 50 microlitres d’hémolymphe diluée dans les puits d’une microplaque de polystyrène à fond plat de 96 puits, traitée au TC, et couvrez la plaque avec son couvercle. Laissez les hémocytes adhérer au fond des puits pendant 30 minutes à 15 degrés Celsius pour former une monocouche.
Ensuite, à l’aide d’une micropipette, aspirez doucement l’excès d’hémolymphe des puits. Pour effectuer des tests à court terme dans un délai d’une à quatre heures, ajoutez immédiatement 100 microlitres de la substance d’intérêt dissoute dans une solution saline physiologique. Pour des expositions prolongées de 24 à 48 heures, incuber les cellules adhérentes en culture avec la substance d’essai dissoute dans le milieu de culture supplémenté à 15 degrés Celsius.
Pour commencer, obtenez les hémocytes cultivés traités avec la substance d’intérêt. Pour une meilleure visualisation des hémocytes, retirez le milieu d’incubation de chaque puits et colorez les cellules avec 100 microlitres de solution de coloration vitale rouge neutre avant la microscopie à intervalle. Incuber les cellules à 15 degrés Celsius dans une chambre climatique pendant 15 minutes.
Après l’incubation, lavez l’excès de colorant et ajoutez 100 microlitres de la substance d’intérêt dissoute dans une solution saline physiologique standard. Insérez la plaque multipuits contenant les cellules traitées dans un lecteur multimode. Effectuez une imagerie en temps réel sur la plaque grâce à la microscopie time-lapse sous un grossissement de 20X et une visualisation en fond clair.
Pour le suivi des cellules et le calcul des paramètres vélocimétriques, obtenez les images individuelles à l’aide du logiciel Gen5 et enregistrez les images dans un dossier sans espace dans le nom. Dans ImageJ, accédez à Fichier, puis à Importer et Séquence d’images. Effectuez le suivi de cellules sur des cellules individuelles à l’aide du plugin de suivi manuel.
Importez des ensembles de données à partir du plug-in de suivi manuel ImageJ dans le logiciel Chemotaxis et Migration Tool. Sélectionnez le nombre de tranches souhaité pour le suivi. Calibrez le logiciel avec les paramètres de taille de pixel X/Y et d’intervalle de temps.
Après avoir défini les paramètres, cliquez sur Appliquer les paramètres. Tracez des trajectoires et exportez-les sous forme d’image. Cliquez sur le bouton Valeurs mesurées pour afficher les résultats et enregistrer les données.
Ensuite, cliquez sur le bouton Statistiques et enregistrez les données de vitesse et de directivité pour la série de pistes. Comparer les paramètres vélocimétriques calculés des cellules témoins avec ceux des hémocytes exposés à la substance d’essai à des concentrations variables. La motilité des hémocytes a été évaluée à l’aide de l’imagerie en accéléré, montrant les mouvements cellulaires individuels sur 10 minutes, avec un suivi cohérent des cellules numérotées sur trois points temporels de zéro, cinq et 10 minutes.
Deux morphotypes d’hémocytes, des cellules étalées et des cellules rondes plus petites en forme d’étoile, ont été observés. Les deux types ont montré des changements de forme continus en raison de l’activité des lamellipodes et des pseudopodes. Les graphiques de vitesse et de directivité ont indiqué que, dans des conditions physiologiques de base, les cellules étalées se déplaçaient plus rapidement que les cellules plus petites.
L’exposition au paracétamol a significativement réduit la motilité des cellules étalées après 24 heures, tandis que les petites cellules n’ont montré aucune réduction de ce type. La franchise des petites cellules a augmenté de manière significative après 24 heures d’exposition au paracétamol, tandis que les cellules étalées ont montré une diminution de la franchise après seulement une heure.
