Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique telles que les mécanismes de régulation des gènes et les relations de cause à effet entre les différents éléments de régulation de la chromatine. Le principal avantage de cette technique est que pour la première fois il est possible de moduler un loci de chromatine avec des enzymes endogènes physiologiquement pertinentes. Généralement, les individus nouveaux à cette méthode auront du mal parce que la culture de souris ESL est intrinsèquement difficile pour ceux qui n’ont pas été formés à la technique.
Une autre démonstration de cette méthode est essentielle car les étapes de l’infection virale cellulaire sont difficiles à apprendre. Le chercheur doit mettre à temps deux lignées distinctes de culture cellulaire et il est nécessaire de surveiller avec vigilance la sécurité pendant ces étapes. Pour commencer le protocole, passage 18 millions de cellules HEK 293T par plaque de 50 centimètres.
Aspirez les vieux supports et ajoutez 10 millilitres d’un salin tamponné au phosphate X, ou PBS. Aspirer le PBS et ajouter trois millilitres de trypsine de 0,05%. Incuber les cellules dans la trypsine pendant huit minutes à 37 degrés Celsius.
Rocher et exploiter les cellules à mi-chemin de l’incubation. Le lendemain, lorsque les cellules ont atteint 60 à 80% de confluence, effectuer une polyéthyllènenimine, ou Î.-P.-É., transfection. Ensuite, mélangez doucement l’ADN, l’Î.-P.-É. et les médias transfection dans un tube conique de 15 millilitres.
Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, ajouter la solution dropwise à la plaque de 15 centimètres. Ensuite, incuber l’échantillon pendant 16 heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain, aspirez les médias et remplacez-les doucement par des supports HEK frais et préchaautés aux plaques de 15 centimètres. Après l’échange de médias, incuber les cellules dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Comptez les cellules à l’amiomètre.
Passage préalablement préparé mESC dans un format de 12 plaques de puits avec 100.000 cellules par puits un jour avant l’infection. Pour les cellules cultivées dans un format de 10 centimètres, aspirer l’ancien média, ajouter cinq millilitres d’un X PBS, aspirer le PBS, et ajouter un millilitre de 0,25% trypsine. Incuber les cellules dans la trypsine pendant huit minutes à 37 degrés Celsius et la roche et tapoter les cellules à mi-chemin de l’incubation.
48 heures après l’échange de médias, enlever et transférer le supernatant des cellules HEK 293T dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le supernatant à 300 fois G pendant cinq minutes pour pelleter les débris cellulaires. Ensuite, filtrez le supernatant à travers une membrane de 0,45 micron.
Concentrez le virus par ultracentrifugeuse avec un rotor SW32 et faites tourner l’échantillon à 72 000 fois G pendant deux heures et demie à quatre degrés Celsius. Alors que le virus se concentre sous ultracentrifugation, traiter le MESC CIA dans la plaque de 12 puits avec tige embryonnaire fraîche ou es médias contenant cinq microgrammes par millilitre de Polybrene. Lorsque la concentration du virus est terminée, aspirez soigneusement le supernatant et suspendez soigneusement la pastille virale dans 100 microlitres d’un X PBS pour éviter l’excès de bulles.
Ajoutez le virus et un X PBS à un tube microfuge de 1,5 millilitre. Vortex le tube au réglage le plus bas pour suspendre complètement le virus. Faites tourner le tube dans une mini centrifugeuse de table pendant cinq à dix secondes pour enlever les bulles.
Ajouter 30 microlitres du virus à chaque puits d’une plaque de puits de 12 puits. Faites tourbillonner la plaque, puis centrifugez les échantillons à 1000 fois G pendant 20 minutes. Remettre la plaque de 12 puits dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain matin, échangez les médias avec de nouveaux médias ES et autorisez l’infection pendant 48 heures. Après 48 heures d’infection, sélectionnez pour les cellules qui ont intégré le plasmide viral en ajoutant l’antibiotique approprié. Changez les médias tous les jours.
Gardez le média de sélection sur les cellules pendant 72 à 96 heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Continuer avec le modificateur épigénétique chimique, ou CEM, la préparation et le traitement en suspendant le CEM en poudre et le sulphoxide diméthyle, ou DMSO, à une concentration de stock d’un millimolaire et une concentration de travail de 100 micromolaires. Une fois que les cellules ont subi une sélection de 72 à 96 heures, divisez les mESC en un format de 12 puits avec 100 000 cellules par puits.
Incuber les cellules dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après incubation, préparez une solution média de 100 nanomolaires CEM avec des supports ES. Utilisez les médias pour alimenter le MESC de la CIA avec un millilitre de puits.
Gardez un puits de cellules sans aucun CEM ajouté pour servir de contrôle. Ensuite, changez les médias en aspirant les anciens médias et en ajoutant un millilitre par CEM fraîchement préparé contenant ou cem médias ES gratuits toutes les 24 heures pour la durée de l’expérience. Après 48 heures de traitement de CEM, imagez les cellules sans traitement de CEM dans les cellules traitées avec le CEM de 100 nanomolar utilisant un microscope de fluorescence.
Prenez des images représentatives à l’aide d’une phase ou d’un champ lumineux pour enregistrer la morphologie mESC à 10 à 40 fois le grossissement. Les cellules auraient dû se former autour de colonies avec quelques cellules différenciées. Sous le canal de fluorescence FITC, imagez les deux conditions cellulaires.
Ensuite, isolez les cellules de contrôle et traitées par cem pour la cytométrie d’écoulement en aspirant le média, en lavant les cellules avec un millilitre d’un X PBS, en aspirant le PBS et en ajoutant 0,25 millilitres de trypsine de 0,25% avec EDTA pendant huit à 10 minutes. Confirmez que les cellules ne sont plus groupées en grosses touffes au microscope à l’aide d’un grossissement 20 fois. Si les cellules ne semblent pas être dans une suspension à cellule unique, les pipette doucement de haut en bas avec une pipette P1000 pour trypsiniser complètement les cellules.
Étanchez la trypsine avec un millilitre de médias frais et resuspendez les cellules à grande vitesse avec une pipette sérologique jusqu’à ce que les cellules soient dans une suspension cellulaire unique. Ensuite, faites tourner les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant, laver les cellules avec un X PBS, et centrifuger les cellules.
Aspirez le supernatant PBS et réutilisez la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon FACS. Effectuez la cytométrie d’écoulement sur environ 50 000 cellules avec les cellules suspendues et exécutez les échantillons à une vitesse de gaine d’environ 5000 cellules par seconde. Enfin, exportez les données pour une analyse plus approfondie.
Les images de phase du système CEM au locus oct4 et au mESC de la CIA sont photographiées après 48 heures de traitement avec 100 nanomolaires de CEM23 ou avec des cellules non traitées indiquent une répression spécifique du GFP. Les images fluorescentes montrent une expression lumineuse de GFP dans les cellules de commande et une expression réduite de GFP dans mESC’s traité avec CEM23. La cytométrie de flux a uniformément indiqué une diminution plus grande de 30% de l’expression de GFP dans le mESC de CIA traité avec 100 nanomolar de CEM23 pendant 48 heures.
L’immunoprécipitation de chromatine, ou CHIP, s’est délecté que 48 heures de traitement avec 100 nanomolar de CEM23 ont diminué le niveau de H3K27ac au locus cible par rapport aux cellules de contrôle. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’être prudent avec les cellules souches embryonnaires de souris. S’ils se différencient pendant le protocole, les résultats seront annulés.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie synthétique pour explorer les mécanismes in vivo dans le génome des mammifères.
