Ce travail est soutenu par des fonds de démarrage de The Jackson Laboratory.

1. Préparation de la Culture Glia souris pour le conditionnement de la culture neuronale <ol><li> Flacons T75 sont revêtues d&#39;une solution de collagène (1:3 de dilution de Purecol en ddH 2 O). Les flacons sont mis debout et a laissé sécher toute la nuit dans une hotte de culture de tissus. </li><li> Tampon de dissection (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 30 mM de glucose, 25 mM d&#39;HEPES, pH 7,4, sans calcium) et des médias gliales (DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 10 unités / ml de pénicilline, 10 ug / ml de streptomycine et Glutamax) sont préparés et conservés à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Le jour de la culture les cellules gliales, les médias glie est chauffé pendant au moins 30 min dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau avant la dissection des cerveaux de souris. Souris embryonnaires ou néonatale sont euthanasiés par décapitation rapide. Cortex cérébral sont disséqués sous un microscope à dissection. </li><li> Tissus cérébraux disséqués sont digérés dans une solution de papaïne (100 ml papaïne et 20 ul DNase I 1% dans 2 ml de tampon de dissection) à 37 ° C for 20 min. </li><li> Après digestion par la papaïne, les tissus du cerveau sont rincés avec 10 ml de milieu gliales préchauffées. Médias gliales fraîches (2 ml) est ensuite ajouté à digérer les tissus du cerveau et les tissus sont triturés avec une pipette en verre polies au feu Pasteur. </li><li> Médias gliales frais (8 ml) est ajouté aux tissus dissociés. Un um 70 cellule-filtre est utilisé pour filtrer la suspension de tissu dissocié. Les cellules sont ensuite ensemencées dans des flacons T75 (habituellement 2-3 embryons de pouvoir ensemencer une fiole T75) et placé dans une cellule de 37 ° C incubateur de culture. </li><li> Le lendemain, les médias des flacons T75 est aspiré. Les flacons sont rincés avec 10 ml de PBS. Médias gliales fraîches (10-15 ml) est ensuite ajouté à chaque flacon. </li><li> Dans les 10-12 jours, gliale dans les flacons T75 devrait être confluentes. Les cellules gliales sont rincées avec du PBS, et 5 ml de trypsine à 0,05% est ajouté à chaque flacon T75. </li><li> Après une incubation de trypsine à 37 ° C pendant 5 min, les cellules gliales sont des cellules dissociées et gliales de chaque flacon T75 sont divisés en deuxrevêtus de collagène différents flacons T75. </li><li> Inserts de culture (Millipore PICM03050) sont préparés en les plaçant dans des plaques de 6 puits, les revêtements de collagène et de l&#39;air de séchage du jour au lendemain. Médias gliales (2 ml) est placée en dessous de chaque insert de culture. </li><li> Les cellules gliales confluentes de flacons T75 sont trypsinisées et ensemencées sur les inserts de culture (un flacon T75 par plaque de 6 puits, 2 ml chaque insert). Ces inserts de culture des cellules gliales seront utilisés pour conditionner les cultures neuronales. </li></ol> 2. Culture neuronale <ol><li> Les lamelles de verre pour la culture neuronale sont nettoyés en les trempant dans 70% HNO 3 au moins une nuit. Lamelles sont ensuite lavées avec DDH 2 O au moins 3 fois, et séché dans un four Isotemp (&gt; 200 ° C) pendant une nuit. </li><li> Lamelles nettoyés sont placés dans une plaque à 6 puits, une lamelle par puits. Lamelles sont recouvertes de poly-L-Lysine solution (2 ml, 0,1% dans 100 mM d&#39;acide borique, pH = 8,5) pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Lapoly-L-Lysine solution est retiré des lamelles et des lamelles sont lavées 3 fois avec autoclave ddH O. 2 Lamelles sont ensuite incubée à 37 ° C pendant la nuit dans des milieux d&#39;étalement (Neurobasal supplémenté avec du sérum de cheval à 5% inactivé par la chaleur, 10 unités / ml de pénicilline, 10 pg / ml de streptomycine, Glutamax incubateur; 2% B27 supplément est ajouté au milieu d&#39;étalement le jour où il est utilisé). </li><li> Le lendemain, les milieux d&#39;étalement est supprimé et 2 ml de milieu frais avec placage B-27 est ajouté à chaque puits qui a une lamelle de verre. </li><li> Des souris gravides (E15-18) sont euthanasiés au CO 2 et souris embryonnaires sont euthanasiés par décapitation. L&#39;hippocampe ou striatum est disséqué du tissu cérébral et placé dans un tube conique de 15 ml avec du tampon glacé dissection, pour la culture de neurones de l&#39;hippocampe ou du striatum neurones épineux de taille moyenne, respectivement. </li><li> Les tissus du cerveau disséqué sont dissociées avec de la papaïne, comme décrit dans les étapes 1.4) et 1.5). </li><li> FaA près de dissociation, le nombre de cellules dans chaque suspension neuronale est compté avec un hémocytomètre. Les neurones sont ensuite ensemencées sur chaque lamelle à une densité de 0,4 x 10 6 cellules par puits d&#39;une plaque à 6 puits et cultivées dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit (les neurones sont DIV 0). </li><li> Pour préparer des inserts de culture des cellules gliales pour le conditionnement des cultures de neurones, les cellules gliales support est retiré des inserts de culture des cellules gliales et milieu frais est ajouté de placage (2 ml dans l&#39;insert et 2 ml en dessous de l&#39;insert). </li><li> Le lendemain (DIV 1), des lamelles avec les neurones sont placés sous les inserts de culture des cellules gliales, une lamelle dans chaque puits. </li><li> Les neurones sont nourris avec la moitié du volume des nouvelles des médias d&#39;alimentation préchauffées (avec B-27) tous les 3-4 jours jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts pour des expériences de transfection et d&#39;imagerie. </li></ol> 3. Transfection <ol><li> Transfection neuronale est réalisée en utilisant Lipofectamine 2000. Pour chaque culture neuronale (une culture par lamelle), 2 plLipofectamine 2000 et 1 pg d&#39;ADN sont utilisés. Frais milieu Neurobasal sans supplément sert à diluer la Lipofectamine et de l&#39;ADN. </li><li> ADN et Lipofectamine sont incubées pendant 20 min à température ambiante après mélange. </li><li> Économisez 1 ml du milieu du dessous de chaque insert de culture les cellules gliales, et 1 ml de l&#39;intérieur de chaque pièce, et de transférer les données sur un tube conique. Ajouter le même volume de médias d&#39;alimentation + B27 au milieu sauvé et incuber à 37 ° C. Ce milieu est utilisé pour la culture neuronale suite à la transfection. </li><li> Après le 20-min Lipofectamine / ADN incubation, les inserts de culture des cellules gliales sont retirés momentanément des plaques de 6 puits. 200 ul de la Lipofectamine / ADN mélange est ajouté à chaque lamelle avec des neurones. Les inserts de culture des cellules gliales sont ensuite retournés à chaque puits, au-dessus des neurones. Génération de bulles sous la membrane des inserts de culture doit être évitée. Neurones sont incubés avec le mélange Lipofectamine / ADN à 37 ° C pendant 2-4 h. </li><li> Après èmee période d&#39;incubation 2-4 h, inserts gliales sont retirés à nouveau. Les milieux de culture avec le mélange Lipofectamine / ADN est éliminé de chaque puits. Les supports enregistrés à l&#39;étape 3,3) est ajouté à neurones (2 ml par puits). Inserts de culture des cellules gliales sont retournés à chaque puits, et les médias gliales de chaque insert est enlevé, et 2 ml du milieu de l&#39;étape 3.3) est ajouté dans chaque pièce. </li><li> Les neurones sont cultivées pendant une heure supplémentaire 24-72 pour permettre l&#39;expression de l&#39;ADNc transfecté avant la FRBR imagerie est réalisée sur ces neurones. </li></ol> 4. FRBR imagerie <ol><li> Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF: 119 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 30 mM de glucose, 2 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, HEPES 25 mM, pH = 7,4) sera utilisé pour le live expériences d&#39;imagerie. Notre système d&#39;imagerie TIRF est spécialement mis en place avec un laser de 100 mW-Cyan pour l&#39;excitation, et une charge de multiplication d&#39;électrons Coupled Device (EMCCD) caméra pour un détecteur. </li><li> Avant d&#39;expériences d&#39;imagerie, le aCSF est averti dans un 37 &amp; dpar exemple, l&#39;eau de bain C pendant au moins 30 min. L&#39;insert de chauffage pour l&#39;imagerie en temps réel est placé sur la platine du microscope, et l&#39;insert de chauffage, laser et la caméra sont chauffés pendant au moins 30 min avant le début des expériences d&#39;imagerie. </li><li> Une lamelle de neurones transfectés est monté dans la chambre de formation d&#39;image en direct. Le aCSF préchauffé est placé dans la chambre après que la chambre est assemblé; cette étape doit être réalisée le plus rapidement possible. </li><li> Une fois la chambre est placée sur l&#39;insert de chauffage sur la platine du microscope, les neurones transfectées sont identifiées visuellement en mode d&#39;imagerie épi-fluorescence. </li><li> Après sains neurones transfectées sont identifiées (voir les figures 1 et 2), nous effectuent généralement 1 min de photo-blanchiment pour éliminer préexistante fluorescence pHluorin sur la membrane plasmique, comme pHluorin-récepteurs sur la membrane plasmique des niveaux très élevés de fluorescence lorsque FRBR imagerie est commencé, ce qui interfère avec la visualisation des ins individuelsévénements ertion. </li><li> Après photoblanchiment, le réglage de gain du multiplicateur d&#39;électrons sur l&#39;appareil photo EMCCD est réglé au maximum, et l&#39;enregistrement est effectué pendant 1 min à 10 Hz. </li><li> Chaque enregistrement contiendra 600 images. Événements d&#39;insertion individuels sont identifiés en jouant à l&#39;arrière d&#39;enregistrement en utilisant ImageJ. Événements d&#39;insertion individuels sont analysés manuellement à l&#39;aide ImageJ. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Conformément culture neuronale est la clé du succès des expériences d&#39;imagerie en direct. Figure 1 montre des neurones de souris hippocampe en culture en utilisant notre protocole de DIV DIV 11 à 18 ans. Il est clair à partir des images que les neurones ont développé des processus vastes et que les processus dendritiques sont couverts denses avec des épines dendritiques, des indications que ces neurones sont en bonne santé dans la culture. Notre protocole de culture peut également être utilisé pour d&#39;autres types de neurones dans le cerveau. Par exemple, nous avons récemment utilisé ce protocole pour la culturestriataux neurones épineux de taille moyenne dans une étude visant à examiner des récepteurs dopaminergiques D2 (DRD2) insertion dans des cultures de neurones du striatum de souris épineux de taille moyenne 9. Figure 2 montre souris striataux neurones épineux moyens cultivées en utilisant notre protocole à DIV 8. Nous avons également réalisé avec succès la FRBR imagerie de superecliptic DRD2s pHluorin-marqués dans ce type de neurone. Figure 3 montre l&#39;expression de pHluorin-étiqueté DRD2 (pH DRD2) dans un neurone épineux moyen et visualisation de pH DRD2 insertion dans ce neurone. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> Figure 1. Souris culture hippocampe en utilisant la méthode de culture de l&#39;interface. DIV: jours in vitro, la journée de la culture est considérée comme DIV 0. A partir des images, il est évident que les neurones hippocampiques matures dans ce type de culture entre 11 et DIV DIV 15. A DIV 11 et 13, les dendrites neuronales sont couverts de filipodes et les épines immatures. A DIV 15 et18, dendrites neuronales sont couverts de grandes épines, une indication de plus de neurones matures. Panneaux de gauche: faible grossissement des images de neurones hippocampiques de souris à différents âges. Panneaux de droite: à très fort grossissement des images (zoom sur dendrites neuronales du panneau de gauche) de neuronales des processus dendritiques avec des épines dendritiques à des âges différents. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> Figure 2. Souris striatale moyen épineux neurone culture en utilisant la méthode de culture de l&#39;interface. Neurones dans les images sont moins DIV 8. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> Figure 3. Une souris moyenne du striatum neurone épineux transfectées avec un super écliptique récepteur pHluorin-étiqueté D2 de la dopamine (pH DRD2). L&#39;image à gauche est la projection d&#39;intensité maximale d&#39;un enregistrement time-lapse (600 images, 100 ms par image). Flèches blanches indiquent individuelle d&#39;insertion vésiculaire de pH-DRD2. Cette image ne conserve les renseignements insertion dans la dimension xy mais perd les informations de temps. L&#39;image de droite montre yt projection d&#39;intensité maximale, dans laquelle la pile est xyt rotation de 90 degrés autour de l&#39;axe y, et le maximum de pixels sur chaque ligne de l&#39;axe des x est projetée sur un seul axe y de pixel. Cette image conserve des informations d&#39;insertion le long de l&#39;axe yt mais perd les informations axe x.

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	<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic.">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li><li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Pour des raisons inconnues, les neurones de souris sont toujours plus difficiles à la culture de neurones de rat. Dans notre expérience, une culture mixte des neurones et des cellules gliales fonctionne bien pour les neurones primaires de souris en culture. Cependant, une telle culture mixte n&#39;est pas adapté pour des expériences d&#39;imagerie TIRF, comme dans ce type de neurones de la culture et de leurs processus ont tendance à croître au-dessus des cellules gliales, situant le corps cellulaires des neurones...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nom du réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaires</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Purifié solution de collagène bovin (Purecol)</td&gt;<td&gt; Avancé Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hank Balanced Salt Solution (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pénicilline-streptomycine (Pen Strep)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdPyruvate de sodium&gt;</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM glycémie élevée</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sérum fœtal bovin (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glutamax</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Papaïne</td&gt;<td&gt; Worthington Biochemical Corp</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease I de pancréas bovin (DNase I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdPhosphate&gt; Dulbecco saline tamponnée (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Trypsine 0,05%</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poly-L-lysine bromhydrate</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Acide borique</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific-</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Moyen Neurobasal</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 sans sérum Supplément</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sérum de cheval de chaleur inactive</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific-</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdInsérer Culture&gt;</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons

Une meilleure compréhension des mécanismes qui régissent le trafic des récepteurs entre la membrane plasmique (PM) et les compartiments intracellulaires nécessite une approche expérimentale avec une excellente résolution spatiale et temporelle. En outre, une telle approche doit également avoir la capacité de distinguer les récepteurs localisés sur la PM de ceux dans les compartiments intracellulaires. Plus important encore, la détection de récepteurs dans une seule vésicule nécessite une sensibilité de détection remarquable, puisque chaque vésicule porte seulement un petit nombre de récepteurs. Les méthodes habituelles pour l&#39;examen trafic des récepteurs comprennent la biotinylation de surface suivie d&#39;une détection biochimique, qui manque à la fois les résolutions nécessaires spatiales et temporelles, et l&#39;examen microscopie à fluorescence de récepteurs de surface immunomarquées, ce qui nécessite la fixation chimique des cellules et manque par conséquent une résolution temporelle suffisante 1-6. Pour surmonter ces limitations, nous et d&#39;autres avons développé et utilisé une nouvelle stragie qui permet la visualisation de l&#39;insertion dynamique des récepteurs dans le PM avec d&#39;excellentes résolutions spatiales et temporelles 7-17. L&#39;approche de marquage comprend de la GFP sensible au pH, l&#39;superecliptic pHluorin 18, pour le domaine extracellulaire N-terminal des récepteurs. Superecliptic pHluorin a la propriété unique d&#39;être fluorescente à pH neutre et non fluorescent à pH acide (pH &lt;6,0). Par conséquent, les récepteurs sont marqués non fluorescente lorsque la lumière à l&#39;intérieur de vésicules acide trafic intracellulaire ou endosomes, et ils deviennent facilement visualiser uniquement lorsqu&#39;il est exposé à l&#39;environnement pH neutre extracellulaire, sur la surface extérieure de l&#39;heure. Notre stratégie permet donc de distinguer les récepteurs de surface de particules provenant ceux dans les vésicules de trafic intracellulaire. Pour atteindre suffisamment de résolutions spatiale et temporelle, ainsi que la sensibilité nécessaire pour étudier le trafic dynamique des récepteurs, nous avons employé interne totale reflètention microscopie à fluorescence (TIRFM), ce qui nous a permis d&#39;atteindre la résolution spatiale optimale de l&#39;imagerie optique (~ 170 nm), la résolution temporelle de la vidéo-microscopie taux (30 images / sec), et la sensibilité à détecter la fluorescence GFP d&#39;un seul molécule. En imagerie pHluorin-récepteurs marqués sous TIRFM, nous avons pu visualiser directement individuelles événements d&#39;insertion du récepteur dans le PM dans les neurones en culture. Cette approche d&#39;imagerie peut potentiellement être appliquée à n&#39;importe quelle protéine membranaire avec un domaine extracellulaire qui pourrait être étiquetés avec pHluorin superecliptic, et permettra à la dissection des mécanismes clés détaillées régissant l&#39;insertion des protéines membranaires (récepteurs différents, les canaux ioniques, transporteurs, etc) à le Premier ministre.

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Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

En marquant les domaines extracellulaires des récepteurs membranaires avec pHluorin superecliptic, et par imagerie par ces récepteurs de fusion dans les neurones de souris en culture, on peut directement visualiser les différents événements d&#39;insertion vésiculaires des récepteurs à la membrane plasmique. Cette technique permet de contribuer à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent l&#39;insertion du récepteur à la membrane plasmique.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K vues.  The Jackson Laboratory. En marquant les domaines extracellulaires des récepteurs membranaires avec pHluorin superecliptic, et par imagerie par ces récepteurs de fusion dans les neurones de souris en culture, on peut directement visualiser les différents événements d'insertion vésiculaires des récepteurs à la membrane plasmique. Cette technique permet de contribuer à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent l'insertion du récepteur à la membrane plasmique.

Vidéo: Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Recherche

Neurosciences

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Tranche de cerveau Biotinylation: Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approche de Mesure région spécifique membrane de protéines plasmatiques traite des adultes neurones

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

Images en direct de la protéine GLUT4 traite des neurones hypothalamiques primaire de souris au microscope de déconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Culture primaire des neurones isolés du cervelet de souris embryonnaire

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...