Nous tenons à remercier les membres actuels et anciens du laboratoire Lien qui a aidé à développer les protocoles décrits ici, en particulier Gin Fonte, qui a développé la procédure initiale. Ce travail a été soutenu par des prix du NIH (AG12423) et l&#39;Association Alzheimer (prix Zenith) au CDL

1) Préparation de nématodes médias Croissance plaques pour le dosage de la paralysie. Paralysie des dosages sont effectués sur la norme de croissance des médias nématode (NGM) plaques utilisées en routine pour C. elegans de propagation et de la génétique (Stiernagle, 2006). <ol><li> Autoclave la solution contenant NaCl NGM, Agar et peptone dans un erlenmeyer et ajouter la quantité appropriée de stériles CaCl 2, l&#39;uracile, cholestérol, 1M MgSO 4 et 1M KPO 4. Aliquote de 10 ml de liquide dans chaque NGM 60 mm x 15 mm boîte de Pétri. Autoriser NGM à solidifier la nuit à température ambiante. </li><li> Si les tests pour les effets de composés / extraits, partie aliquote de l&#39;extrait sur chaque assiette et l&#39;utilisation d&#39;un épandeur à répartir uniformément l&#39;extrait sur la surface de la plaque. Laissez sécher une nuit d&#39;extrait à température ambiante. Les volumes de plus de 1 mL, il faudra plus de temps à sécher. </li><li> Spot chaque assiette avec 250 pi de E. OP5O coli souche cultivée dans les médias LB nuit pour une densité optique de 0,4-0,6. Permettent aux bactéries de sécher une nuit à température ambiante. </li></ol> Les variables pertinentes L&#39;âge des plaques a un effet significatif sur le dosage de la paralysie, car les anciennes plaques ont tendance à sécher. Utiliser des plaques versé dans la semaine du dosage paralysie. Pour des résultats optimaux, verser les plaques 3-4 jours avant l&#39;initiation des populations de vers synchrone [voir (2) ci-dessous]. Pour toute expérience, utilisez uniquement des plaques versé à partir du même lot. Modifier la taille de la pelouse (ie repéré vs propagation) et / ou le type de bactéries va également modifier le comportement des vers. Paralysie des dosages peuvent être effectués en utilisant d&#39;autres E. coli comme source de nourriture (par exemple, la souche HT115 utilisées dans l&#39;alimentation des expériences ARNi), mais cela peut changer la cinétique de la paralysie, ce qui nécessite des contrôles internes appropriés. 2) Préparation des populations de vers à l&#39;âge synchrones Strain CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aßi minigène + rol-6 du gène marqueur (su1006)] X est le plus couramment utilisé pour le dosage de Aß induite par la paralysie Cette souche et d&#39;autres modèles transgéniques sont disponibles. aux chercheurs universitaires pour une somme modique à partir du Centre de Caenorhabditis Génétique (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Afin de maximiser la synchronie âge de la population test, il est préférable de commencer avec une génération synchronisée parentale. Une semaine avant l&#39;ouverture de la paralysie de dosage de la population d&#39;essai, utiliser un sélecteur de ver de platine pour le transfert de 20 à 30 adultes gravides sur plusieurs plaques de 10 cm NGM répandit avec OP50 pour un oeuf 2 heures était à 16 ° C (la température permissive pour CL4176 ). Retirez les adultes gravides et de permettre la progéniture de grandir pendant 7 jours, date à laquelle ils seront &quot;deuxième journée&quot; adultes gravides. </li><li> (Jour 1) La deuxième journée des adultes gravides sont utilisées pour préparer les populations critère de l&#39;âge synchrone. Pour chaque condition expérimentale de l&#39;objet est de générer des plaques en triple contenant de 50 à 75 ans-synchrone vers. Utilisation d&#39;un sélecteur de ver de platine, le transfert 10-12 du 2 jours adultes gravides sur 60 mm (10 ml de volume) plaques NGM tacheté de OP50. Autoriser les vers à pondre des oeufs à 16 ° C pendant 2 heures, puis enlever les adultes et de permettre aux oeufs d&#39;éclore et grandir à 16 ° C. À ce stade, il est préférable d&#39;avoir quelqu&#39;un qui ne sera pas marquer les plaques pour les coder, de sorte que le meilleur buteur sera aveugle aux conditions expérimentales. </li></ol> Les variables pertinentes Le stade de développement embryonnaire lorsque les œufs sont pondus (~ le stade de 26 cellules pour des vers de type sauvage dans des conditions optimales) est une fonction de l&#39;âge adulte et la nutrition. Si les adultes gravides utilisé pour la préparation de la population de test sont plus âgés ou morts de faim, les oeufs ultérieurement seront portées, en réduisant la synchronie âge de la population et de la reproductibilité de la cinétique de la paralysie. Il est essentiel que les mono-axéniques (c&#39;est à dire, seulement OP50 bactéries) les cultures sont utilisés (les contaminants microbiens peuvent gravement affecter ce test), et la reproductibilité est plus élevé si les plaques triple ont le même nombre de vers. 3) induction Transgene et Assay Paralysie <ol><li> (Jour 3) plaques monter les rapports jusqu&#39;à 25 ° C 48 heures après la fin de l&#39;œuf synchrones laïque; les vers doivent être au troisième stade larvaire (L3). Les plaques doivent être disposées sans empiler dans un incubateur à 25 ° C pour permettre toutes les plaques d&#39;atteindre 25 ° C dans le même temps. </li><li> (Jour 4) Commencez notation de la paralysie de vers (souche CL4176) à 18-20 heures après le début du changement de vitesse. À ce stade, tous les vers de la population devraient avoir atteint les larves de quatrième (L4) scène. Continuer score à deux heures par incréments jusqu&#39;à ce que tous les vers sur chacune des plaques sont paralysés. Pour des raisons inconnues, la paralysie est même pas sur toute la longueur du corps: la tête de la région est la dernière partie du ver de cesser de bouger. Ainsi, wORMULAIRES qui ont récemment lancé une paralysie ne peut pas traduire à travers la plaque, mais peut se déplacer de leur tête, ouvrant ainsi les bactéries autour de leurs antérieure et en laissant un «halo» de bactéries effacés. Ces vers immanquablement devenir complètement paralysé, et donc des vers avec des halos sont classés comme paralysé. Certains vers n&#39;aurez pas de halos, mais ne sera également pas montrer le mouvement spontané; ils sont testés par les aiguillonner avec le sélecteur de ver. Si un ver poussés ne peuvent pas subir une propagation complet du corps vague après insistance, il est aussi marqué que paralysé. Pour la notation efficace, il est plus facile de déplacer les vers paralysée à un secteur sans tache de la plaque de sorte qu&#39;ils ne seront pas involontaire réécrite de la période de cotation suivant. (Cela permet aussi mal classé des vers afin de démontrer le mouvement, permettant une correction notation). </li><li> Pour générer une courbe de la paralysie, à chaque point de la fraction de vers sur chaque assiette qui n&#39;ont pas été paralysée est convertie en un pourcentage, et la moyenne &quot;paralysés&quot; pourcentage est fonction du temps de l&#39;initiation monter les rapports. (La justification de comploter dans ce sens est que la courbe obtenue est formellement analogue à une courbe de survie, et peuvent donc être analysés en utilisant la norme statistiques de survie non paramétriques.) </li></ol> Les variables pertinentes La montée des rapports de vers myo-3/Aβ transgéniques doit se produire avant qu&#39;elles n&#39;atteignent le stade de la mi L4 pour la paralysie d&#39;être initié, comme le myo-3 promoteur est régulée par le développement, et a considérablement réduit son expression dans L4 en retard ou des vers adultes. De même, l&#39;expression de ce transgène est bloqué si les vers deviennent affamés, il est donc essentiel que les vers sont bien nourris tout au long de l&#39;expérience. Nous n&#39;avons jamais observé un ver paralysés de récupérer dans n&#39;importe quelles conditions, et après 12 à 16 h de monter les rapports, toutes CL4176 vers se paralyser, même si elles sont downshifted à 16 ° C. Dans la souche CL4176, régulation à la hausse suffisante de l&#39;expression du transgène pour provoquer la paralysie peut survenir à des températures plus basses (ie, 20-25 ° C) même si le calendrier de paralysie sera modifié. Le taux de paralysie dépend de la souche spécifique transgéniques utilisées (nous avons construit des souches myo-3/Aβ avec les deux taux plus rapide et plus lent que CL4176), donc avec des souches de la fenêtre de notation alternatifs peuvent avoir besoin d&#39;être ajustée. Résultats Représentant 4) Montre la figure 1 est un tracé d&#39;une courbe de la paralysie pour CL4176, à la fois non traitées et exposées à 6,27 mM de caféine (concentration finale dans la plaque NGM). Ce traitement conduit à un retard statistiquement très significative de la paralysie d&#39;environ 4 heures, que nous interprétons comme une indication de la suppression de la toxicité Aßi dans ce modèle. Montre la figure 2 est une expérience indépendante dosant les effets de cafestol, un autre composé qui se trouve dans le café. Cette parcelle est typique pour des traitements qui n&#39;ont pas d&#39;impact toxicité Aß. Notez que dans les deux expériences environ la moitié des populations traitées CL4176 sont paralysés à 24 heures, et la paralysie est complète en 28 h. Ces délais sont typiques de la paralysie de contrôle CL4176 populations. Des écarts significatifs à partir de ce moment sont révélateurs de modifier les conditions environnementales ou la suppression spontanée des copies du transgène. (CL4176 contient un tableau de chromosomes intégrée transgéniques avec plusieurs copies du transgène myo-3/Aβ. Bien que ce tableau transgénique est normalement très stable, toute propagation de la souche à des températures&gt; 16 ° C sélectionnera pour les vers rares qui ont subi une suppression spontanée des transgènes, résultant en des variantes qui aura réduit l&#39;expression Aßi et les résultats de paralysie plus lent.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Courbe de paralysie pour la souche CL4176 les vers non traités ou exposés à la caféine 6,27 mM (Sigma). Les délais indiqués sont de l&#39;initiation du changement de vitesse de la température. Les barres d&#39;erreur = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Les barres d&#39;erreur courbe de la paralysie pour CL4176 vers exposés à 0,48 mM cafestol (Sigma). = SEM

<ol>
	<li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer's+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans.">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li><li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta.">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li><li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer's+disease+amyloid+beta-peptide+(1-42)+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model.">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li><li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants.">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li><li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans.">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li><li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein.">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li><li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li></ol>

Le protocole que nous avons décrits peuvent être utilisés efficacement pour doser les effets des composés sur la toxicité Aß. Publié exemples incluent les effets des constituants d&#39;extrait de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) et la réserpine (Arya et al. 2009). Les composés qui ont été protection contre la toxicité Aßi dans d&#39;autres systèmes ont également été montré pour avoir un effet protecteur dans ce modèle (par exemple, la mémantine, nos résultats non publiés). Une justification importante pour l&#39;établissement de ce modèle est que les outils bien développés génétiques et moléculaires disponibles en C. elegans peut être utilisée pour étudier les mécanismes de toxicité Aß. Ainsi, les mutations des effets spécifiques sur la toxicité Aßi peut être dosée (par exemple, l&#39;effet de réduire insulin-like de signalisation par l&#39;introduction d&#39;un daf-2 avec perte de fonction de mutation, Florez-McClure et al. 2007), et ce modèle peut également être utilisé pour examiner les effets de la sur-expression des transgènes (Fonte et al. 2008). Nous avons récemment fait un large usage de ce modèle pour étudier les effets sur la toxicité de simples substitutions d&#39;acides aminés dans les Aß (données non publiées). Le modèle transgénique décrite ici l&#39;effet des dosages d&#39;expression Aßi aiguë sur la fonction des cellules musculaires. Au moment de la paralysie des cellules musculaires et de leurs sarcomères sont intacts; le phénotype paralysie n&#39;est pas le résultat de la mort des cellules musculaires. Cependant, après la paralysie (~ 48 heures après la montée des rapports initiaux) il ya une rupture de l&#39;intégrité musculaire et la mort éventuelle des vers. Nous n&#39;avons pas enquêté sur cet effet en aval d&#39;expression Aßi ou utilisé comme un marqueur de toxicité. Le modèle expression inductible Aßi décrite ici n&#39;est pas appropriée pour enquêter sur les traitements qui modulent β-amyloïde la formation en soi. Bien que les vers transgéniques avec la forme Aßi expression constitutive des dépôts amyloïdes facilement détectables (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), les vers transgéniques à expression inductible Aßi ont rarement des dépôts amyloïdes et le phénotype de paralysie apparaît indépendante des dépôts amyloïdes (Drake et coll. 2003). Nos résultats sont cohérents avec l&#39;idée que la toxicité aiguë de l&#39;expression des résultats induits Aßi de l&#39;accumulation de Aß oligomériques solubles, pas de dépôts amyloïdes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Quantity/2L </td><td> Société / Catalogue # </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 147.02mg/mL dans le trou DDH 2 O </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 2mL </td><td></td><td> 2mg/mL dans le trou DDH 2 O </td></tr><tr><td> Cholestérol </td><td> 2mL </td><td></td><td> 5mg/mL dans de l&#39;éthanol (ne pas autoclave) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 246.5mg/mL dans le trou DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ML, 48 mg K2HPO4/mL dans le trou DDH 2 O, le pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying &beta;-amyloid toxicity using a transgenic c. elegans model

L&#39;accumulation du peptide β-amyloïde (Aß) est généralement considéré comme central pour l&#39;induction de la maladie d&#39;Alzheimer, mais le mécanisme pertinent (s) de toxicité sont encore mal connus. Aßi est également déposée par voie intramusculaire dans myosites à inclusions, une myopathie sévère humaine. Le elegans intensément étudié ver nématode Caenorhabditis transgénique peut être modifié pour exprimer Aßi humaine. Selon le tissu ou le calendrier d&#39;expression Aßi, vers transgéniques peuvent avoir des phénotypes facilement mesurables qui servent comme une lecture de la toxicité Aß. Par exemple, des vers transgéniques à expression pan-neuronal Aßi avoir des défauts est l&#39;apprentissage associatif (Dosanjh et al 2009.), Tandis que les vers transgéniques avec des muscles spécifiques à l&#39;expression constitutive montrent une progressive, dépendant de l&#39;âge phénotype paralysie (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Un particulièrement utile C. elegans modèle emploie une mutation thermosensible dans le système de surveillance à l&#39;ingénieur d&#39;expression d&#39;ARNm musculaire inductible par la température d&#39;un transgène Aßi, résultant en un phénotype de paralysie reproductibles lors de changement de vitesse de la température (Link et al. 2003). Les traitements qui Aßi contrer la toxicité de ce modèle [par exemple, l&#39;expression d&#39;un transgène de protection (Hassan et al. 2009) ou l&#39;exposition à des extraits de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproductible modifier le taux de paralysie induite par monter les rapports de température de ces transgéniques des vers. Nous décrivons ici notre protocole pour mesurer le taux de paralysie dans ce transgéniques C. modèle elegans, avec une attention particulière aux variables expérimentales qui peuvent influencer cette mesure.

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Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Le ver nématode intensément étudié<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Peut être transgénique conçue pour exprimer la β-amyloïde humaine peptide (Aß). Expression induite de Aß dans le<em&gt; C. elegans</emMusculaire&gt; conduit à une rapide, une paralysie phénotype reproductible qui peut être utilisé pour surveiller les traitements qui modulent la toxicité Aß.

Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans</emModèle>

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

25.3K vues.  University of Colorado. Le ver nématode intensément étudié Caenorhabditis elegans Peut être transgénique conçue pour exprimer la β-amyloïde humaine peptide (Aß). Expression induite de Aß dans le C. elegans conduit à une rapide, une paralysie phénotype reproductible qui peut être utilisé pour surveiller les traitements qui modulent la toxicité Aß.

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Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Dosage activité locomotrice d&#39;étudier les rythmes circadiens et le sommeil dans les paramètres Drosophile</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo laser axotomie en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Suivi et évaluation comportementale

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...