Cette étude a été soutenue par le Département américain de l&#39;Énergie (DE-FG02-09ER09-08 et DE-PS02-09ER09-18), le Centre Anti Cancéreux Jonsson Comprehensive de l&#39;UCLA, et le Programme de l&#39;industrie-université de recherche coopérative (UC subvention à la découverte, bio07 -10 665). Nous remercions le Dr Nagichettiar Satyamurthy et le personnel à l&#39;installation de l&#39;UCLA Biomedical Cyclotron pour fournir le F-18 radio-isotopes et des discussions perspicaces nombreuses. Nous remercions les Drs. Michael Collins, Greg Leblanc, Joseph Lambert, et Keller Barnhardt du CEM pour leurs conseils techniques et de soutien. Nous tenons à remercier Dirk Williams, Darin Williams, les Drs. Joseph Hong Dun Lin, et Michael van Dam pour les pièces de la conception et l&#39;usinage de modifier le réacteur à micro-ondes CEM et pour les modules de purification SPE.

1. Les premiers préparatifs <ol><li> Un V-flacon (5 ml) RV1 (avec agitation bar) est utilisé comme récipient à réaction principale pour réaliser la synthèse micro-ondes. Il est connecté à un adaptateur PEEK avec sept entrée / sortie des ports se connecte et placé à l&#39;intérieur de la cavité micro-onde (voir figure 2). RV2 est connecté à cartouche SPE (I) pour recueillir le brut [18 F] SFB. RV3 est connecté à cartouche SPE (II) pour la collecte de la finale [18 F] SFB solution. Il peut être placé dans un bain d&#39;eau tiède (40 ° C) pour concentrer la solution correspondante avant de reconstituer dans un tampon PBS, en particulier pour le radiomarquage aval de biomolécules. </li><li> Configuration de la collecte brute [18 F] SFB: Remplissez MeCN / H 2 O [6 ml; 1:4 (v: v)] solution aqueuse à 5% AcOH (8 ml), MeCN (2 ml) pour le réservoir A, B et C, respectivement. Puis activer une cartouche SPE (I) (polystyrène, Merck LiCholut FR) avec de l&#39;éthanol (10 ml), suivie par aqueuse à 5% AcOH (10 ml) à laver. </li><li> Configuration de la collecte purifiée [18 F] SFB: Préparer réservoir D et E rempli avec 10 ml de H 2 O et 3 ml d&#39;éther éthylique, respectivement. La seconde cartouche SPE (II) (polystyrène, Merck LiCholut FR) est activé par la même procédure mentionnée ci-dessus. </li><li> Démarrez le CLHP (tampon d&#39;élution: MeCN / H 2 O, 1:1 (v / v) contenant 0,2% TFA; débit: 3 ml / min) pour le pré-conditionnement de la colonne de CLHP [une phase inverse semi-prep colonne (Luna, 5 um C18 (2) 100 A, 250 x 10 mm), Phenomenex, Torrance, CA, USA]. </li></ol> 2. Préparation du séchées [ie non porteur ajoutée, (NCA)] [18 F] de fluorure <ol><li> [18 F] une solution de fluorure dans [18 O] H 2 O (100 pi) a été ajouté à un mélange de Kryptofix 222 (20 mg), aqueuse 1M de K 2 CO 3 (26 pi) et MeCN (0,8 ml) dans un Eppendorf tube. La solution complète est alors bien mélangé avant d&#39;être transféré à l&#39;RV1 via la ligne d&#39;entrée 1. Le [18 F] une solution de fluorure peut aussi être passé à travers une cartouche anioniques de change (par exemple, l&#39;AMQ-légers Sep-Pak de Waters) pour piéger le fluor-18 et ensuite éluée avec un mélange de K 2 CO 3 et Kryptofix dans MeCN. </li><li> Exécuter la séquence de séchage (20W, 3 min) en vertu du programme de contrôle à micro-ondes pour éliminer l&#39;eau résiduelle dans RV1 [sous vide]. Après le refroidissement de la température du système est inférieure à 50 ° C, MeCN supplémentaires (1,0 ml) a été introduit dans le réacteur et la séquence est répétée une fois. </li></ol> 3. Synthèse de l&#39;éthyl-4 - [18 F] fluorobenzoate <ol><li> Pour une solution de DMSO (0,4 ml) contenant éthyl-4 - (N, N, N-triméthylammonium) benzoate de triflate (1,5 mg) a été ajouté dans RV1 via la ligne d&#39;arrivée 2. </li><li> Exécuter la séquence d&#39;étiquetage (50W, 1 min) dans le cadre du programme de contrôle à micro-ondes avec un refroidissement cuve sous agitation, et toutes les vannes fermées à payer éthyl-4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). </li></ol> 4. Synthèse du 4 potassium - [18 F] fluorobenzoate <ol><li> Pour une solution de DMSO (0,5 ml) contenant KOtBu (13 mg) a été ajouté dans RV1 via la ligne d&#39;entrée 3. </li><li> Exécuter le programme Déprotéger (40 W, 1 min) dans le cadre du programme de contrôle à micro-ondes avec un refroidissement cuve sous agitation, et toutes les vannes fermées à payer les 4 - [18 F] fluorobenzoate sel ([18 F] 3). </li></ol> 5. Synthèse de brut [18 F] SFB <ol><li> Pour une solution d&#39;acétonitrile (2,5 ml) contenant TSTU (30 mg) a été ajouté à RV1 via la ligne d&#39;entrée 6. TSR à l&#39;humidité et la lumière sensible. Il devrait être répartie dans des flacons de petites et conservés à 4 ° C dans un récipient couvert et fermé par une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Exécuter la séquence d&#39;accouplement (30W, 2 min) en vertu du programme de contrôle à micro-ondes avec un refroidissement cuve sous agitation, et toutes les vannes fermées à payer le brut [18 F] SFB. </li></ol> 6. La préparation de la SPE-purifiée [18 F] SFB <ol><li> Aqueuse à 5% AcOH (1,0 ml) a été ajouté à RV1 via la ligne d&#39;entrée de 7 à neutraliser le mélange réactionnel. La solution a ensuite été transféré en B flacon contenant 8 ml d&#39;AcOH aqueuse à 5% (figure 2). </li><li> Passez le mélange réactionnel dilué par cartouche SPE (I) à piège grossier [18 F] d&#39;azote à l&#39;aide du SFB (10 psi). </li><li> WASH cartouche SPE (I) avec un mélange de MeCN et H 2 O [10 mL, 1:4 (v: v)] du réservoir A. </li><li> [18 F] SFB a été élue à l&#39;aide en RV2 MeCN (2 ml) du réservoir C. </li></ol> 7. Purification du brut [18 F] SFB avec Radio-HPLC <ol><li> Diluer soit bruts [18 F] SFB ou SPE-purifiée [18 F] SFB avec H 2 O (2 ml) de RV2 et transférer le mélange dans la boucle HPLC (5 ml). La solution a été injectée dans le radio-HPLC [O MeCN / H 2, 1:1 (v / v) contenant 0,2% TFA; débit: 3 ml / min]. </li><li> Recueillir la fraction purifiée contenant [18 F] SFB (rétention Time: 8-10 minutes) dans le flacon (pré-rempli avec 10 ml de H 2 O) D (figure 2). Une étape cruciale: s&#39;il est effectué correctement, le volume fraction recueillie ici devrait être 4-5 ml. </li><li> Passez le mélange réactionnel dilué par cartouche SPE (II) pour piéger purifiée [18 F] d&#39;azote à l&#39;aide du SFB (10 psi). Sécher la cartouche avec un courant d&#39;azote pendant 2-3 minutes. </li><li> [18 F] SFB a été élue à l&#39;aide en RV3 diéthyléther (3 ml) du réservoir E.. </li><li> Evaporer le solvant RV3 à sec par un léger courant d&#39;azote gazeux (10 psi) en utilisant un bain d&#39;eau (40 ° C). Le séchées final [18 F] SFB peut être reconstitué dans du tampon PBS pour l&#39;application en aval. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: Nous avons développé une version simplifiée, rapide, un pot-méthode de synthèse [18 F] SFB utilisant une stratégie de déprotection dans des conditions anhydres et le chauffage micro-ondes pendant chaque transformation radiochimique / chimiques. La figure 1 présente les détails de notre radiosynthèse. L&#39;identité du produit final a été confirmé par la comparaison des temps de rétention HPLC avec une référence non radioactifs SFB. Le purifiée [18 F] SFB a également été analysé par la radio-TLC et HPLC-afin de déterminer son radiochimique et la pureté chimique. Le RCY du [18 F] SFB était de 35 ± 5% dans les 60 min après purification par HPLC (n&gt; 30), avec une pureté radiochimique élevée (&gt; 99%) et une bonne pureté chimique (voir la trace UV dans le profil HPLC, la figure 3 ). L&#39;activité spécifique a été env. 67-330 GBq / mol (1,8 à 9,0 Ci / mol), selon la radioactivité de départ. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Microwave assistée one-pot radiosynthèse du [18 F] SFB. Premièrement, le radiofluorination d&#39;éthyl-4 - (N, N, N-triméthylammonium) benzoate de triflate (1) a été réalisée sous chauffage micro-ondes (50 W, 1 min), en présence de [K ⊃ 2.2.2] [18 F] F - complexe dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour donner le 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). Sans purification, une solution de DMSO de tert-butoxyde de potassium (t BuOK) a été ajouté et le réacteur a été irradié à micro-ondes (40 W, 1 mn) pour compléter la déprotection anhydre. La conversion finale du [18 F] 3 dans [18 F] SFB a été réalisé en utilisant O-(N-succinimidyle) - N, N, N &#39;, N&#39;-tétraméthyluronium (TSR) d&#39;activation. TSR dans l&#39;acétonitrile a été ajoutée au mélange réactionnel contenant le 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 3) le sel; cette dernière étape de synthèse donné brut [18 F] SFB après chauffage (30 W, 2 min). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Le schéma de la configuration des micro-ondes assisté one-pot [18 F] SFB synthèse. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Radio-HPL chromatogrammes de finale [18 F] SFB. En haut: signal UV à 254 nm; en bas: le signal radioactif; en médaillon: le signal UV à 254 nm (x 33,3). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="Tableau 1" /> . Tableau 1 Récapitulatif des [18 F] radiosyntheses SFB rapportés dans la littérature en utilisant alkyle 4 - (triméthylammonium) triflate benzoate comme précurseurs.

Cette méthode a été soumis pour la demande de brevet US.

Cela a simplifié en trois étapes, un pot de radiosynthèse des 18 F-acylation réactifs [18 F] SFB est développé sur la base non aqueuse chimie. Ce processus a une excellente reproductibilité et pourrait être utilisé de manière fiable pour la production de [18F] SFB dans les modules de radiochimie automatisé, grâce à deux modifications clés décrits comme suivants: 1. Nous employons une étape de déprotection / saponification en anhydre KOtBu / DMSO système pour remplacer l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> l&#39;acide acétique en solution aqueuse (5%, v / v) </td><td> Fisher </td><td> A38-500 </td><td> Préparé dans notre laboratoire </td></tr><tr><td> Acétonitrile </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 75-05-8 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éther diéthylique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 14775 </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472301 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyl 4 - (N, N, N-triméthylammonium) benzoate de triflate </td><td> Préparé dans le laboratoire </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1 ,10-diazabicyclo [8.8.8] hexacosane (K222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 29,111-0 </td><td></td></tr><tr><td> O - (N-succinimidyle) - N, N, N &#39;, N&#39;-tétraméthyluronium (TSR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 105832-38-0 </td><td></td></tr><tr><td> Le carbonate de potassium en solution aqueuse (1M) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 209619 </td><td> Préparé dans notre laboratoire </td></tr><tr><td> Tert-butoxyde de potassium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 156671 </td><td></td></tr></tbody></table>

microwave-assisted one-pot synthesis of n-succinimidyl-4-[18f]fluorobenzoate ([18f]sfb)

Biomolécules, y compris des peptides, 1-9 protéines, 10,11 et les anticorps et leurs fragments conçu, 12-14 gagnent en importance à la fois comme agents thérapeutiques potentiels et des agents d&#39;imagerie moléculaire. Notamment, quand étiquetés avec des radio-isotopes émettant des positrons (par exemple, Cu-64, Ga-68 ou F-18), ils peuvent être utilisés comme sondes pour l&#39;imagerie ciblée de nombreux processus physiologiques et pathologiques. 15-18 conséquent, des efforts importants ont consacrée à la synthèse et l&#39;exploration de 18 F-étiquetés biomolécules. Bien qu&#39;il existe des exemples élégant de la 18 F-étiquetage directe de peptides, 19-22 les conditions de réaction sévère (c.-à-solvant organique, le pH extrêmes, température élevée) associée à radiofluorination directs sont généralement incompatibles avec les échantillons de protéines fragiles. À ce jour, par conséquent, l&#39;incorporation de groupements prosthétiques radiomarqué dans des biomolécules reste la méthode de choix. 23,24 N-succinimidyl-4-[18 F] fluorobenzoate ([18 F] SFB), 25-37 un réactif du type de Bolton-Hunter, qui réagit avec les groupes amino primaire de biomolécules, est un groupe très polyvalent prothétique pour le 18 F-étiquetage d&#39;un large éventail d&#39;entités biologiques, en termes de son évidente stabilité in vivo et le rendement élevé de radiomarquage. Après marquage avec [18 F] SFB, le résultant [18 F] biomolécules fluorobenzoylated pourraient être explorées comme traceurs PET potentiels dans les études d&#39;imagerie in vivo. La plupart des 1 [18 F] radiosyntheses SFB décrits dans les littératures actuelles exigent deux ou même trois réacteurs et purifications multiples en utilisant soit l&#39;extraction en phase solide (SPE) ou la chromatographie liquide haute performance (CLHP). Ces longs processus d&#39;entraver sa production de routine et des applications répandues dans le radiomarquage des biomolécules. Bien que plusieurs modules assistée [18 F] synthèses SFB ont été signalés, 29-32, 41-42, ils sont principalement basées sur des procédures longues et compliquées en utilisant coûteuses boîtes radiochimie commercialement disponibles (tableau 1). Par conséquent, une nouvelle simplification des radiosynthèse du [18 F] SFB en utilisant une configuration à faible coût serait très bénéfique pour son adaptation à un processus automatisé. Ici, nous rapportons une préparation concise du [18 F] SFB, basé sur une version simplifiée one-pot micro-ondes synthèse assistée (figure 1). Notre approche ne nécessite pas de purification entre les étapes ou tout réactifs aqueux. En outre, l&#39;irradiation micro-ondes, qui a été utilisé dans les synthèses de plusieurs traceurs TEP, 38-41 donne peut plus RCYs et une meilleure sélectivité que les réactions correspondantes thermique ou qu&#39;ils fournissent des rendements similaires dans les temps de réaction plus courts. 38 Plus important encore, lorsque l&#39;étiquetage des biomolécules , le temps ainsi économisé pourrait être détournée vers bioconjugaison ultérieure ou une étape d&#39;imagerie TEP 28,43 La nouveauté de notre améliorée [18 F] SFB synthèse est double: (1). déprotection de la stratégie anhydre ne nécessite pas de purification de l&#39;intermédiaire (s) entre chaque étape et (2) le micro-transformations radiochimiques aidé permettre la rapide, une production fiable de [18F] SFB.

Watch this Scientific Journal Video about Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB at JoVE.com

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Une facile, un pot de synthèse du N-succinimidyl-4-[<sup&gt; 18</sup&gt; F] fluorobenzoate ([<sup&gt; 18</sup&gt; F] SFB) a été développé basé sur une non-aqueuse, un processus en trois étapes radiochimique. Utilisant un chauffage à micro-ondes, toute la procédure peut être complété en moins de 30 min ou 60 min avec une purification supplémentaire par HPLC préparative. La décroissance des rendements corrigés radiochimique (RCYs) étaient 35-5% (n&gt; 30).

Micro-ondes assisté one-pot de synthèse des N-Succinimidyl-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

Research

JoVE Journal

Biology

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

12.9K vues.  University of California at Los Angeles. Une facile, un pot de synthèse du N-succinimidyl-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB) a été développé basé sur une non-aqueuse, un processus en trois étapes radiochimique. Utilisant un chauffage à micro-ondes, toute la procédure peut être complété en moins de 30 min ou 60 min avec une purification supplémentaire par HPLC préparative. La décroissance des rendements corrigés radiochimique (RCYs) étaient 35-5% (n> 30).

Vidéo: Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Optimisation de la réaction de Ugi utilisant la synthèse parallèle et automatisé de manipulation des liquides

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Recherche

Biologie

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthèse et d&#39;étalonnage des nanosondes phosphorescent pour l&#39;imagerie oxygène dans les systèmes biologiques

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

Synthèse d&#39;un<em&gt; In vivo</em&gt; Sonde apoptose détectable par IRM

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Synthèse en phase solide d&#39;un bis-fonctionnalisé peptide en utilisant &quot;Sécurité Catch&quot; Méthodologie

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

La synthèse in vitro de l&#39;ARNm modifié pour l&#39;induction de l&#39;expression des protéines dans les cellules humaines

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthèse de la longueur d&#39;onde de décalage d&#39;ADN à l&#39;aide de sondes d&#39;hybridation cyanine photostable

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

Évaluation des taux de synthèse des protéines de novo à Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...