Les auteurs remercient le Professeur Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, et le Dr Serge Lyaschenko pour des conversations utiles.

Toutes les expériences in vivo d&#39;animaux décrits ont été réalisés selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques de la Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité (IACUC). 1. Conjugaison du MPO-NCS à J591 <ol><li> Dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 ml, préparer une solution à 2-5 mg / ml de J591 dans 1 ml d&#39;une solution saline 1x tamponnée au phosphate (pH 7,4) ou du tampon HEPES 0,5 M (pH 7,4). </li><li> Dissoudre MPO-NCS dans le DMSO sec à une concentration comprise entre 5 à 10 mM (3.8 à 7.6 mg / ml). Soniquer ou vortex soigneusement la solution pour faciliter la dissolution complète. </li><li> Ajuster le pH de la solution de J591 à 8,8 à 9,0 en ajoutant de petites portions aliquotes (&lt;10 pi) de 0,1 M de Na 2 CO 3. </li><li> Une fois la solution d&#39;anticorps est à la bonne pH, ajouter un volume de la solution DFO-NCS correspondant à un excès molaire de 3 à 4 fois de l&#39;agent chélatant bifonctionnel. <ol><li> Pour examenple, ajouter 4-5 ul d&#39;un 10 mm (7,6 mg / ml) de la solution MPO-NCS (40,4 nmol MPO-NCS) à 1 ml d&#39;une / ml solution d&#39;anticorps J591 2 mg (13,3 nmol J591). La quantité de DMSO dans le mélange aqueux de réaction finale ne doit pas dépasser 2% v / v. </li></ol></li><li> Incuber le mélange réactionnel pendant 30 min à 37 ° C sur un bloc chauffant agitant à 350 tours par minute. </li><li> Après 1 h à 37 ° C, purifier l&#39;immunoconjugué résultant en utilisant une colonne de dessalage exclusion pré-emballé avec une taille jetable 50000 poids moléculaire de coupure en utilisant un tampon HEPES 0,5 M (pH 7,4) comme éluant. Cette étape permettra d&#39;obtenir une solution 2 ml du produit de construction J591-DFO terminé. </li><li> Mesurer la concentration de la J591-MPO construire sur un spectrophotomètre UV-Vis. </li><li> Si une concentration plus élevée de la construction est souhaitée, concentrer la solution J591-DFO utilisant une unité de filtre centrifuge à 50 000 en poids moléculaire limite. </li><li> Conserver la solution de l&#39;immunoconjugué J591-MPO terminé à -20 ° C dans l&#39;obscurité. </ol> 2. Radiomarquage J591-MPO avec 89 Zr ATTENTION: Cette étape du protocole impliquant le traitement et la manipulation de radioactivité. Avant d&#39;effectuer ces étapes ou effectuer d&#39;autres travaux avec des chercheurs de radioactivité devraient consulter avec le Département de la radioprotection de leur établissement d&#39;origine. Toutes les mesures possibles doivent être prises pour réduire l&#39;exposition aux rayonnements ionisants. NOTE: Dans l&#39;intérêt de la note tenue radiochimique bon, la quantité de radioactivité dans l&#39;échantillon doit être mesurée à l&#39;aide d&#39;un calibrateur de dose et enregistrée avant et après les étapes 2.2 à 2.13 dans le protocole ci-dessous. Cela aidera à la détermination précise des rendements radiochimiques et des activités spécifiques. <ol><li> Préparer une solution de 0,5 à 2,0 mg de J591-MPO dans 200 pi de tampon HEPES 0,5 M, pH 7,5. </li><li> Pipeter le volume de la &lt;sup&gt; 89 Zr 4+ solution stock (généralement fourni dans 1,0 M d&#39;acide oxalique) correspondant à 1,0 à 6,0 mCi (37 à 222 MBq) dans un tube en plastique à centrifuger à bouchon à vis 2 ml. Réglez le volume de cette solution à un total de 300 ul en utilisant l&#39;acide oxalique 1,0 M. </li><li> Ajuster le pH de la solution 89 Zr 4+ 6.8 à 7.5 à l&#39;aide de 1,0 M de Na 2 CO 3. Commencer par l&#39;ajout de 250 ul de 1,0 M de Na 2 CO 3 à la solution 89 Zr 4+ et ensuite ajouter plus petit (&lt;10 ul) des aliquotes d&#39;une base pour obtenir le pH désiré. </li><li> Ajouter la quantité désirée de pH ajusté 89 Zr 4+ solution à la solution J591-DFO préparé à l&#39;étape 2.1. </li><li> Vérifier le pH du mélange de réaction de radiomarquage pour se assurer qu&#39;elle tombe dans la plage souhaitée de 6/8 à 7/5. </li><li> Incuber la réaction de radiomarquage de 60 min à température ambiante sur un bloc chauffant agitant à 350 tours par minute. </li><li> Après 60 min d&#39;incubation, mesurer la radiolabeling rendement de la réaction utilisant la radio-CCM. <ol><li> À cette fin, 1 pCi de repérer le mélange de réaction de radiomarquage sur une bande de CCM silice imprégné. Autoriser l&#39;aliquote sécher, exécutez le CCM en utilisant un éluant mM DTPA (pH 5,5) 50 et d&#39;analyser la bande CCM en utilisant un scanner radio TLC. 89 Zr 4+ lié à la construction J591-MPO apparaîtra à l&#39;origine (R f &lt;0,1), tandis que des cations libres 89 Zr 4+ sont chélatés par DTPA et se éluer avec le front de solvant (Rf&gt; 0,9). </li><li> Calculer le rendement de radiomarquage de la réaction en intégrant le radiochromatogramme, en divisant l&#39;aire sous la courbe de Rf de 0,0 à 0,1 par l&#39;aire totale sous la courbe, et en multipliant par cent. </li></ol></li><li> Si le rendement de radiomarquage est suffisant (typiquement une activité spécifique théorique de&gt; 2 mCi / mg), de stopper la réaction avec 5 pl de 50 mM de DTPA à pH 5,5. </li><li> Purifier l&#39;immunoconjugué usi résultantng une colonne exclusion dessalage pré-emballé taille jetable avec un 50 000 poids moléculaire de coupure en utilisant un éluant soit 0,9% de solution saline stérile avec 5 mg / acide gentisique ml ou 0,25 M d&#39;acétate de sodium (pH 5,5) avec 5 mg / ml d&#39;acide gentisique . Cette étape sera d&#39;obtenir une solution 2 ml de terminé le 89 radioimmunoconjugué Zr-DFO-J591. </li><li> Après purification, vérifier la pureté radiochimique du 89 Zr-DFO-J591 utilisant la radio-CCM comme décrit dans l&#39;étape 2.7. </li><li> Calculez le rendement de radiomarquage global de la réaction en divisant le montant de l&#39;activité initialement ajouté à la solution d&#39;anticorps par la quantité de radioactivité isolé avec le purifiée radioimmunoconjugué 89 Zr-DFO-J591. </li><li> Calculer l&#39;activité spécifique finale en divisant le montant de l&#39;activité isolé avec le purifiée 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugué par la masse initiale de MPO-J591 dans la réaction de radiomarquage. </li><li> Si une concentration plus élevée est souhaitée, se concentrer ee 89 solution Zr-DFO-J591 utilisant une unité de filtre centrifuge avec un 50,000 poids moléculaire de coupure. NOTE: L&#39;acide gentisique utilisé dans l&#39;étape de purification finale est une radio-protecteur employé pour minimiser la dégradation de l&#39;anticorps due à la radiolyse 46 Bien que le stockage de la 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugué jusqu&#39;à 48 heures à 4 ° C. est possible, il ne est pas recommandé. Si le radioimmunoconjugué doit être stockée, en utilisant 0,25 M d&#39;acétate de sodium (pH 5,5) avec 5 mg d&#39;acide gentisique / ml en tant que le tampon de stockage, afin de minimiser le risque de la radiolyse de l&#39;hypochlorite à médiation 47. </li></ol> 3. In Vivo imagerie TEP avec 89 Zr-DFO-J591 ATTENTION: Comme dans la section protocole n ° 2, cette étape du protocole impliquant le traitement et la manipulation de radioactivité. Avant d&#39;effectuer ces étapes chercheurs devraient consulter avec le Département de la radioprotection de leur établissement d&#39;origine. Tous possibLe mesures devraient être prises pour minimiser l&#39;exposition aux rayonnements ionisants. <ol><li> Chez les souris nudes athymiques mâles, implant sous-cutanée 5 x 10 cellules de cancer de la prostate LNCaP et 6 permettent à ceux-ci atteignent une xénogreffe de 100 à 150 mm 3 (3-4 semaines après l&#39;inoculation). 44 </li><li> Diluer le radioimmunoconjugué 89 Zr-DFO-J591 à une concentration de 1,0 mCi / ml dans 0,9% de solution saline stérile. </li><li> Injecter 200 ul de la solution 89 Zr-DFO-J591 (200 uCi; 7,4 MBq). Dans la veine caudale latérale des souris de xénogreffes portant 48 </li><li> Au point de temps de formation d&#39;image souhaité (par exemple, 12, 24, 48, 72, 96, ou 120 heures après l&#39;injection), anesthésier les souris avec 2% d&#39;isoflurane: mélange de gaz d&#39;oxygène. </li><li> Placer la souris sur le lit de la petite scanner TEP animale, et maintenir l&#39;anesthésie pendant l&#39;analyse en utilisant un 1% d&#39;isoflurane: mélange de gaz d&#39;oxygène. Avant de placer l&#39;animal sur la vitre du scanner, vérifiez l&#39;anesthésie en utilisant la méthode et appl toe-pincementpommade ophtalmique y les yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant l&#39;anesthésie. 49 </li><li> Acquérir les données de PET pour la souris via une analyse statique avec un minimum de 40 millions d&#39;événements coïncidents en utilisant une fenêtre d&#39;énergie de 350-700 keV et une fenêtre de cadencement de coïncidence de 6 nanosecondes. 50 </li><li> Après avoir complété l&#39;acquisition de l&#39;image, ne laissez pas la souris sans surveillance et ne pas le placer dans une cage avec les autres souris jusqu&#39;à ce qu&#39;il a repris conscience. </li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Alors que la construction, radioimmunoconjugués radiomarquage, et l&#39;imagerie de 89 Zr-DFO-étiqueté est généralement une procédure assez simple, il est important de garder quelques considérations clés à l&#39;esprit au cours de chaque étape du processus. Par exemple, peut-être la cause la plus probable de préoccupation lors de l&#39;étape de conjugaison de la procédure est l&#39;agrégation de l&#39;anticorps au cours de la réaction de conjugaison. Ce problème est le plus souvent un produit...

En raison de leur sensibilité remarquable, l&#39;affinité et la sélectivité, les anticorps ont longtemps été considérés comme des vecteurs prometteurs pour la délivrance de radio-isotopes à des cellules cancéreuses. Toutefois, leur application dans la tomographie par émission de positons (TEP) a été entravée par l&#39;absence d&#39;un radio-isotope émetteur de positons adapté à leur étiquetage. 1-3 Une des considérations les plus critiques dans la conception de radioimmunoconjugués est correspondant à la décroissance physique demi- vie du radio-isotope à la pharmacocinétique in vivo de l&#39;anticorps. Plus précisément, les anticorps ont souvent, multi-jours des demi-vies biologiques relativement longues et donc doivent être étiquetés avec des radio-isotopes avec des demi-vies physiques comparables. Pour les applications d&#39;imagerie PET, des anticorps ont été traditionnellement marqué à 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h), ou 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4, 5 Cependant, chacun deces radio-isotopes possède des limites importantes qui entravent leur aptitude à l&#39;imagerie clinique. Alors que radioimmunoconjugués marqués avec 86 Y et 64 Cu ont prouvé prometteuse dans les enquêtes précliniques, deux isotopes possèdent des demi-vies physiques qui sont trop courts pour être efficace pour l&#39;imagerie chez l&#39;homme. 124 I, en revanche, a une demi-vie physique presque idéal pour l&#39;imagerie avec des anticorps, mais il est coûteux et présente des caractéristiques de désintégration sous-optimales qui conduisent à relativement basse résolution des images cliniques. En outre, 124 radio-immunoconjugués I-marqué peut être soumis à une déshalogénation in vivo, un procédé qui peut abaisser les rapports d&#39;activité tumeur-à-fond. 6,7 Le lecteur de trouver un radio-isotope émetteur de positons à supplanter 64 Cu, 86 Y, et 124 I dans radioimmunoconjugués a alimenté la récente flambée des recherches sur 89 anticorps Zr-étiquetés. 8-12 Til raison de l&#39;avènement de 89 Zr est simple: l&#39;radiométal possède des propriétés physiques et chimiques quasi-idéal et pour une utilisation dans radioimmunoconjugués PET diagnostic 13 89 Zr est produit par la 89 Y (p, de n) 89 réaction Zr sur un cyclotron en utilisant un. disponibles dans le commerce et 100% naturelle abondante 89 cible Y 14,15. Le métal radioactif a un rendement de 23% de positron, se désintègre avec une demi-vie de 78,4 heures, et émet des positons avec l&#39;énergie relativement faible de 395,5 keV (figure 1). 13,16,17 Il est important de noter que 89 Zr émet également une grande énergie, 909 keV γ-ray avec 99% d&#39;efficacité. Bien que cette émission ne interfère pas énergiquement avec les photons émis 511 keV, il ne nécessite examen supplémentaire en matière de transport, de manutention, et la dosimétrie. Malgré cette réserve, ces caractéristiques de désintégration définitive signifie que 89 Zr a non seulement une plus favorable half-vie pour l&#39;imagerie avec des anticorps de 86 Y et 64 Cu, mais peuvent aussi produire des images haute résolution de 124 I, qui émet des positons avec des énergies plus élevées de 687 et 975 keV ainsi que d&#39;un nombre de photons avec des énergies au sein de 100-150 keV de les photons de positons créé 511 keV. 13 En outre, 89 Zr est aussi plus sûr à manipuler, moins cher à produire, et esidualise dans les tumeurs plus efficacement que son homologue de l&#39;iode radioactif. 18,19 Une limitation potentielle de 89 Zr, ce est qu&#39;il n&#39;a pas un isotopologue thérapeutique, par exemple, 86 Y (PET) contre 90 Y (thérapie). Cela empêche la construction de chimiquement identiques, agents d&#39;imagerie de substitution qui peuvent être utilisés comme éclaireurs dosimétriques pour leurs homologues thérapeutiques. Cela dit, les enquêtes suggèrent que 89 Zr anticorps marqués ont un potentiel comme substituts d&#39;imagerie pour 90 Y et 177 Lu-immunoconjugués marqués.20,21 Du point de vue chimique, comme un métal du groupe IV, 89 Zr existe en tant que cation 4 en solution aqueuse. L&#39;ion Zr est fortement chargée, relativement importante (rayon ionique efficace = 0,84 Å), et peut être classé comme un cation &quot;dur&quot;. En tant que tel, il présente une préférence pour les ligands portant jusqu&#39;à huit disques, les donateurs anioniques d&#39;oxygène. Facilement le chélateur le plus couramment utilisé dans 89 radioimmunoconjugués Zr-étiquetés est desferrioxamine (MPO), un sidérophore dérivés, chélateur acyclique portant trois groupes hydroxamate. Le ligand coordonne de manière stable le cation Zr 4+ rapidement et proprement à la température ambiante à des niveaux de pH biologiquement pertinentes, et le complexe Zr-MPO résultant reste stable au cours de plusieurs jours dans une solution saline, le sérum sanguin, et le sang total. 22 études computationnelles suggèrent fortement que le MPO forme un complexe hexacoordiné de Zr 4+ dans laquelle le centre métallique est coordiné à trois neutral et trois donneurs d&#39;oxygène anioniques du ligand ainsi que les deux ligands exogènes d&#39;eau (Figure 2). 23,24 Le comportement in vivo des radioimmunoconjugués employant la conjugaison échafaudage 89 Zr-MPO a généralement été excellente. Cependant, dans certains cas, l&#39;imagerie et les études de biodistribution aiguës ont révélé des niveaux d&#39;activité élevés dans les os des souris injectées avec 89 des anticorps Zr-marquées, des données qui suggèrent que la ostéophile 89 Zr 4+ cation est libéré de l&#39;agent chélatant in vivo et ensuite minéralise dans l&#39;os. 25 Récemment, un certain nombre d&#39;enquêtes sur le développement de nouveaux 89 Zr 4+ chélateurs ligands particulièrement avec huit donneurs d&#39;oxygène ont été publiés dans la littérature. 24,26,27 Néanmoins, à l&#39;heure actuelle, le MPO est le chélateur la plus largement utilisée dans 89 radioimmunoconjugués Zr marqué par une large marge. Une grande variété destratégies de bioconjugaison ont été utilisées pour attacher le MPO à des anticorps, y compris bioorthogonal chimie clic, la réaction d&#39;un thiol réactif MPO construit avec cysteines dans l&#39;anticorps, et la réaction de l&#39;ester activé portant MPO construit avec lysines dans l&#39;anticorps. 4,28- 30 Facilement la stratégie la plus courante, cependant, a été l&#39;utilisation d&#39;un dérivé de l&#39;isothiocyanate portante du MPO, le MPO-NCS (Figure 2). 22 Ce chélateur bifonctionnel disponible dans le commerce robuste et fiable des formes stables, des liaisons covalentes de thiourée avec les lysines de la anticorps (figure 3). Au cours des dernières années, une grande variété de 89 radioimmunoconjugués Zr-DFO-marqués ont été rapportés dans la littérature. Études précliniques ont été particulièrement abondante, avec des anticorps qui vont de la plus connue cetuximab, le bevacizumab et le trastuzumab à des anticorps plus ésotériques comme le CD105 ciblage TRC105 et fPSA ciblage 5A10. 30-36 Plus récemment, un petit nombre d&#39;essais cliniques de phase précoce en utilisant des anticorps 89 Zr-DFO-marquées sont apparues dans la littérature. Essais spécifiquement, les groupes aux Pays-Bas ont publié employant 89 Zr-DFO-CMAb U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxétan, et 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 En outre, une série d&#39;autres essais cliniques avec 89 radioimmunoconjugués Zr-étiquetés sont actuellement en cours, y compris les enquêtes ici au Memorial Sloan Kettering Cancer Center à l&#39;aide de la LMFP ciblage 89 Zr-DFO-J591 pour l&#39;imagerie du cancer de la prostate et le 89 Zr-DFO-trastuzumab HER2-ciblage pour l&#39;imagerie du cancer du sein. 23, 30 En outre, alors que les anticorps radiomarqués restent les 89 produits radiopharmaceutiques marqués Zr plus courantes, le métal radioactif a également été utilisée de plus en plus avec d&#39;autres vecteurs, y compris des peptides, des protéines, et des nanomatériaux. 38-43 </sup&gt; La modularité de ce 89 Zr-MPO méthodologie d&#39;étiquetage est un atout formidable. Le répertoire d&#39;anticorps de ciblage biomarqueurs est en pleine expansion, et de l&#39;intérêt dans l&#39;exécution de l&#39;imagerie PET vivo en utilisant ces constructions est de plus en plus rapidement. En conséquence, nous croyons que le développement de pratiques et de protocoles normalisés plus pourrait bénéficier le domaine. Un excellent protocole expérimental écrite pour le MPO-NCS conjugaison et 89 Zr radiomarquage a déjà été publié par Vosjan, et al. 22 Nous pensons que la démonstration visuelle fournie par ce travail pourrait en outre aider les enquêteurs à ces nouvelles techniques. Dans le protocole à la main, l&#39;antigène de membrane de ciblage J591 d&#39;anticorps spécifique de la prostate est utilisé comme système modèle pour illustrer (1) la bioconjugaison du chélateur bifonctionnel DFO-isothiocyanate à un anticorps, (2) la radiosynthèse et la purification de la 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué,et (3) in vivo l&#39;imagerie TEP avec un 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué dans un modèle murin de cancer. 23,44,45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

L&#39;exceptionnelle affinité, la spécificité et la sélectivité des anticorps rendent vecteurs extrêmement attrayantes pour les médicaments radiopharmaceutiques PET tumorales ciblées. En raison de leur demi-vie biologique de plusieurs jours, les anticorps doivent être étiquetés avec des radionucléides émetteurs de positrons avec relativement longues désintégration physique des demi-vies. Traditionnellement, les isotopes émettant des positrons 124 I (t 1/2 = 4.18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h), et 64 Cu (t 1/2 = 12,7 heures) ont été utilisés pour marquer des anticorps pour l&#39;imagerie TEP. Plus récemment, cependant, le domaine a connu une augmentation considérable de l&#39;utilisation de la tomographie par émission de métal radioactif 89 Zr en PET agents d&#39;imagerie à base d&#39;anticorps. 89 Zr est un radio-isotope presque idéal pour l&#39;imagerie PET avec des immunoconjugués, car il possède une moitié physique -La vie (t 1/2 = 78,4 h) qui est compatible avec la pharmacocinétique in vivo des anticorps et émet un relativement faible ènergy positrons qui produit des images haute résolution. En outre, les anticorps peuvent être carrément marqués avec 89 Zr utilisant le chélateur de desferrioxamine sidérophores dérivée (MPO). Dans ce protocole, l&#39;antigène de membrane de ciblage J591 d&#39;anticorps spécifique de la prostate est utilisé comme système modèle pour illustrer (1) la bioconjugaison du chélateur bifonctionnel DFO-isothiocyanate à un anticorps, (2) la radiosynthèse et la purification d&#39;un 89 Zr MPO-mAb radioimmunoconjugué, et (3) in vivo l&#39;imagerie TEP avec un 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué dans un modèle murin de cancer.

La première étape de ce protocole la conjugaison du MPO-NCS à l&#39;anticorps est généralement assez robuste et fiable. Généralement, le, immunoconjugué chélateur modifié purifié peut être obtenu à un rendement&gt; 90%, et en utilisant trois équivalents molaires de DFO-NCS dans la réaction de conjugaison initiale donnera un degré de marquage de l&#39;agent chélatant d&#39;environ 1,0 à 1,5 MPO / mAb. Les 89 Zr radiomarquage et de purification étapes de la procédure sont également simple. ...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

La bioconjugaison et radiosynthèse de<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorps Zr-DFO-étiquetés

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

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17.0K vues.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Inspired Auto-assemblage de particules à motifs et reconfigurable

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

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Chimie

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Formation de structures ordonnées biomoléculaires par l&#39;auto-assemblage de peptides courts

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-et-piscine Synthèse et caractérisation de peptides tertiaire Amide Bibliothèque

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional units (e.g., domains). Traditional consensus-building models fail to account for interpositional dependencies &#8211; functionally required covariation of residues that tend to appear simultaneously throughout evolution and across the phylogentic tree. These relationships can reveal important clues about the processes of protein folding, thermostability, and the formation of functional sites, which in turn can be used to inform the engineering of synthetic proteins. Unfortunately, these relationships essentially form sub-motifs which cannot be predicted by simple &#8220;majority rule&#8221; or even HMM-based consensus models, and the result can be a biologically invalid &#8220;consensus&#8221; which is not only never seen in nature but is less viable than any extant protein. We have developed a visual analytics tool, StickWRLD, which creates an interactive 3D representation of a protein alignment and clearly displays covarying residues. The user has the ability to pan and zoom, as well as dynamically change the statistical threshold underlying the identification of covariants. StickWRLD has previously been successfully used to identify functionally-required covarying residues in proteins such as Adenylate Kinase and in DNA sequences such as endonuclease target sites.

Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.

Optimisation des protéines synthétiques: Identification des dépendances interposition indicatrice constructivement et / ou les résidus fonctionnellement liées

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthèse des bioconjugués protéiques<em&gt; via</em&gt; Cystéine-maléimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Regards sur les interactions des acides aminés et Peptides avec matériaux inorganiques à l&#39;aide d&#39;une seule molécule de travail Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Synthèse et analyse de spectrométrie de masse des Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Synthèse et bioconjugaison de Thiol-réactifs pour la création de Site-sélectivement modifiés immunoconjugués

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...