Ce protocole utilise une méthode recyclable et modifiée pour produire des composés spirocycliques. Le test MTT permet de répondre à la question relative à la cytotoxicité de ces nouvelles molécules. Cette technique produit de nouvelles molécules modifiables à l’aide d’un matériau de départ régénérant.
Le test MTT fournit des résultats biologiques relativement rapides et faciles à analyser Commencez par effectuer une synthèse en phase solide des hétérocycles spirocycliques six et sept, comme démontré précédemment. Préparer 20 millilitres d’une solution de MTT de cinq milligrammes par millilitre en utilisant du PBS stérile comme diluant. Filtrer et conserver la solution à moins 20 degrés Celsius.
Ensuite, préparez une dilution univoque de la solution de MTT dans DMEM. Préparer un millilitre chacun de solutions mères dans des tubes microcentrifugés de 1,5 millilitre de composés d’essai dans du DMSO. Conservez-les à moins 20 degrés Celsius.
Préparer 200 microlitres par dose des solutions de travail des composés d’essai en diluant les concentrations des stocks. Un à 1000 dans le milieu libre de sérum. Dans les graines de culture tissulaire, sept cellules COS en milieu complet sur une culture tissulaire à fond plat ont traité 96 plaques de puits à une concentration de 4 000 cellules par 200 microlitres par puits.
Utilisation d’un pipeter multicanal. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, aspirez le surnageant des puits à l’aide d’une pipette de pâturage en verre fixée à une pompe à vide.
Doser les cellules en trois exemplaires avec les composés d’essai en utilisant les solutions de travail préalablement préparées. Retournez ensuite les cellules dans l’incubateur. Après 24 heures, aspirez le surnageant des puits et ajoutez 200 microlitres de solution MTT à chaque puits.
Incuber l’assiette pendant quatre heures. Aspirer doucement le surnageant des puits sans déranger les cristaux de formazane pourpre. Ajouter 200 microlitres de DMSO à chaque puits pour dissoudre les cristaux.
Incuber ensuite la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Mesurez l’absorbance de chaque puits à 590 ou 600 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques à 96 puits. Utilisez des puits sans cellules comme fond et faites la moyenne de la valeur d’absorbance.
Les veines Spirocycliques six et sept ont été synthétisées à l’aide d’un protocole modifié. La progression de la réaction a été surveillée en détectant la disparition de l’esther alpha bêta insaturé par spectroscopie infrarouge. Le test MTT a été utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire.
Le cisplatine, connu pour induire la mort cellulaire à des concentrations élevées, a servi de témoin positif. Comme prévu, plus la concentration de cisplatine est élevée, plus la viabilité cellulaire est faible. Le test MTT a ensuite été utilisé pour tester les composés spirocycliques six et sept et la furfurylamine.
La furfurylamine et la veine de gox spirocyclique six ont montré une cytotoxicité similaire. Cependant, la toxicité du composé spirocyclique sept était sensiblement supérieure à celle de la furfurylamine et du six. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la N-alkylation réalisée à l’aide d’halogénures d’acyle volumineux s’est avérée réduire le taux d’élimination bêta, réduisant ainsi le rendement du produit.
