Les auteurs tiennent à remercier le Dr Zachary Z. Brown et Jennifer Alleva pour le développement initial de cette technique de synthèse en phase solide et Matthew Parker FL pour des discussions utiles. Ce travail est soutenu par la Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) et le Horst Witzel Fellowship Award soutenu par Cephalon, Inc

1. Installation <ol><li> La réaction d&#39;ouvertures pour la synthèse en phase solide est une cartouche de filtre ou de polypropylène réacteur en verre qui est connecté via un tube de polypropylène à une fiole fermée filtration sous vide conformément à la figure 1. La réaction peut être mélangé par un agitateur magnétique ou par barbotage d&#39;azote dans le réacteur. </li><li> Un collecteur de gaz relié à un cylindre d&#39;Argon équipé d&#39;un tube de séchage et de barboteur à huile est également recommandé car il permet la cuve de réaction à être contenue dans une atmosphère inerte et permet l&#39;élimination des réactifs des conteneurs hermétiques. </li><li> Toutes les opérations sont effectuées sous une hotte et un équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, blouse de laboratoire et des gants en nitrile) est nécessaire. </li></ol> 2. Chargement d&#39;abord Bis-peptide sur résine <ol><li> Peser 114 mg de HMBA-AM Résine (0,88 mmol / g de chargement, 100 umol) dans 8 ml cuve de réaction et d&#39;ajouter une barre d&#39;agitation magnétique. Boucher le haut de ee navire avec un septum en caoutchouc et d&#39;une purge du tube avec de l&#39;argon pendant au moins 5 minutes. </li><li> Dans l&#39;intervalle, pèsent 117,3 mg du composé 1 de la figure 3 (586,63 g / mol, 2eq) et 59,2 mg de 1 - (mésitylène-2-sulfonyl)-3-nitro-1 ,2,4-triazole (MSNT, 296,0 g / mol, 2eq) dans un tube de 15 ml centrifugeuse jetable et dissoudre dans 2 ml de dichlorométhane anhydre (DCM). Ajouter 24 uL de 1-méthylimidazole (NMI, 80,81 ml / mol, 3EQ) à la solution et mélanger jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Transférer la solution activée à l&#39;aide d&#39;une seringue récipient de réaction et laisser sous agitation sous argon nuit (~ 10 heures). </li><li> Retirer le septum et vidanger le mélange réactionnel. Laver la résine avec du DCM (5x) et le diméthylformamide (DMF) (5x). Effectuez l&#39;opération &quot;rouge de méthyle test&quot; décrit dans l&#39;article 10.1 afin d&#39;évaluer le degré de charge de résine. Si la résine reste rouge pendant le test au rouge de méthyle puis les étapes 2.2 et 2.3 doit être répété. Une couleur jaune, signe d&#39;un test de rouge de méthyle négatif, est préféré;Cependant, étant donné que toute autres groupes hydroxyles seront plafonnés à l&#39;étape suivante, un résultat légèrement positif (lumière de couleur en résine orange) peut être acceptable. </li></ol> 3. La déprotection de résine bis-peptide et simultanée d&#39;abord Plafonnement <ol><li> Ajouter 1 ml de DCM à la cuve de réaction, puis ajouter 1 ml de bromure d&#39;hydrogène de 33% en goutte à goutte d&#39;acide acétique de plus de 30 secondes se produit un bullage) et laisser agiter pendant 15 minutes. Égoutter et laver la résine avec du DCM (5x), puis répétez le traitement une fois de plus. </li><li> Laver la résine avec du DCM (5x), puis le DMF (5x). Neutraliser la résine par lavage deux fois avec un 5% v / v de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA) dans du DMF puis laver au DCM (5x) et de DMF (5x) à nouveau. Effectuer le &quot;test du rouge de méthyle&quot; et &quot;test chloranile&quot; discuté à la section 10.1 et 10.2. Les résultats devraient être négatifs pour le rouge de méthyle test et positif pour le test chloranile. </li></ol> 4. Couplage Boc / tBu-protégé fonctionnalisé Bis-Amipas d&#39;acide <ol><li> Réintroduire une atmosphère inerte à la résine contenant du récipient de réaction par lavage trois fois avec DCM anhydre puis fixer une ligne de septum et l&#39;argon. Purger et laver le récipient en ajoutant 1-2 ml de DCM anhydre et en laissant remuer pendant 30 secondes, puis vidange de la cuve jusqu&#39;à ce que l&#39;argon ligne barboteur commence à monter. Pour ce faire, au moins une fois de plus. </li><li> Préparer une solution de 0,15 M fonctionnalisé bis-amino-acide (3EQ) et 245 mg de 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) dans 2 mL de 2:1 DCM: DMF dans un test séché à la flamme tube sous atmosphère d&#39;argon. Ajouter 47 ul de diisopropylcarbodiimide (DIC, 156,6 ml / mol, 3EQ) et agiter pendant 90 minutes. </li><li> Ajouter 35 uL DIPEA (174,19 ml / mol, 2eq) dans 666 ul DMF anhydre à la résine et de permettre à remuer pendant 5 minutes. </li><li> Transférer la solution pré-activé l&#39;acide bis-amino à la cuve de réaction moyen d&#39;une seringue et laisser agiter pendant une nuit. </li><li> Égoutter le mélange réactionnel et laver deux fois avec du DCM anhydre tandis que sous<html> l&#39;argon. </li><li> Pour favoriser la fermeture de la dicétopipérazine, ajouter une solution 0,25 M de HOAt (136,11 g / mol, 10eq) et DIC (156,6 ml / mol, 10eq) dans un 4 ml de 1:1 DCM: DMF et laisser sous agitation sous argon pendant 1 heure. </li><li> Retirer le septum et vidanger le mélange réactionnel. Laver la résine avec du DCM (5x) et de DMF (5x). Si vous le souhaitez, effectuer le &quot;test de chloranile&quot; discuté à la section 10.2. </li></ol> 5. Déprotection de Boc / tBu-protégé fonctionnalisé Bis-amino-acide <ol><li> Ajouter 2 ml d&#39;une solution de l&#39;acide 95:5 trifluororacetic (TFA): triisopropylsilane (TIPS) à la cuve de réaction et de lui permettre de remuer pendant 1 heure. Égoutter et laver la résine pendant environ 30 secondes avec du DCM (5x), puis répéter le processus une fois de plus. </li><li> Laver la résine avec du DCM (5x), puis le DMF (5x). Neutraliser la résine par lavage deux fois avec un 5% v / v de solution de DIPEA dans du DMF puis laver le DCM (5x) et de DMF (5x) à nouveau. Si vous le souhaitez, effectuer le &quot;test de chloranile&quot; discuté à la section 10.2. </li></ol>Le &quot;Répétez les étapes&gt; 6. 4 et 5 comme vous le souhaitez pour synthétiser ciblée bis-peptide. 7. La fonctionnalisation de la fin Prolidine Bis-Peptide <ol><li> L&#39;extrémité prolidine du bis-peptidique en croissance peut être acylé indépendamment ou ensemble par une dicétopipérazine. De plus, cette extrémité peut être laissé protégés, qui sera coupé ci, donnant l&#39;acide aminé libre. Si vous le souhaitez, effectuer le &quot;test de chloranile&quot; discuté à la section 10.2 pour évaluer l&#39;efficacité du couplage. </li></ol> 8. La déprotection de Fmoc et acylation de la fin du Quaternaire de la Bis-Peptide <ol><li> Une solution de 2 ml de pipéridine 20% dans du DMF est ajouté et le mélange réactionnel est mélangé pendant 20 minutes. Égoutter et laver la résine avec du DMF (5x), puis répéter le processus une fois de plus. </li><li> Laver la résine avec du DCM (5x), puis le DMF (5x). </li><li> Préparer une solution à 0,15 M d&#39;acide aminé (3EQ) dans 2 ml de N-méthylpyrrolidone (NMP) avec 114 mg de 2 - (7-aza-1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tétraméthyluronium<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3EQ) et de 104,5 ul DIPEA (174,19 ml / mol, 6EQ) et bien mélanger. Ajouter à la cuve de réaction et permettre de remuer pendant 6 heures. </li><li> Laver la résine avec du DCM (5x), puis le DMF (5x). </li></ol> 9. Retirez le Groupe de Boc lié à la résine d&#39;acides aminés et Cleave de résine <ol><li> Ajouter 2 mL d&#39;une TFA 1:1: solution de DCM à la cuve de réaction et permettre de remuer pendant 30 minutes. Égoutter et laver la résine avec du DCM (5x), puis répétez le traitement une fois de plus. </li><li> Lavez et égouttez la résine pendant 30 secondes avec du DCM (5x), puis du DMF (5x). </li><li> Ajouter 2 ml d&#39;une solution de DIPEA 10% dans le DMF anhydre et permettent de mélanger les 24-48 heures. </li><li> Recueillir mélange réactionnel en pré-pesé ballon à fond rond. Transfert 30 uL de cette solution à 450 pl de THF dans un flacon LC-MS et de soumettre à l&#39;analyse. Laver la résine avec des aliquotes supplémentaires de DMF et de recueillir dans le ballon à fond rond, puis éliminer le solvant sous vide. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Purification de Bis-Peptide <ol><li> Dissoudre brut bis-peptide dans une quantité minimale de diméthylsulfoxyde (100-250 pi) et le transfert dans l&#39;insert flacon HPLC. Insérer le placer dans échantillonneur automatique de semi-prepitive système HPLC (HP 1100 série) équipé d&#39;une XTerra MS Préparation C18 5 mm de colonne um 7.8x150 et une boucle d&#39;injection 100 pi. </li><li> Effectuer plusieurs injections de 50 ml de l&#39;échantillon en utilisant un programme de gradient d&#39;acétonitrile 5-95% dans de l&#39;eau avec de l&#39;acide formique 0,1% pendant 30 minutes tout en surveillant à 274 nm. Recueillir le pic du produit dans un tube à centrifuger pré-pesée jetable et lyophiliser l&#39;aide d&#39;un lyophilisateur. Il faut être prudent avec la première manche comme un léger décalage dans le temps de rétention maximale par rapport aux LCMS analyse est généralement observée. </li></ol> 11. Méthodes d&#39;évaluation <ol><li> Rouge de méthyle ESSAI 7: Retirer ~ 1 mg de résine sèche par l&#39;intermédiaire d&#39;une pipette jetable et rincer en 4 ml cuve de réaction. Ajouter une solution de 20 mg rouge de méthyle, 50 N ul, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC), et 5 mg de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) dans 500 ul DCM anhydre et laisser agiter pendant 5-10 minutes. Égoutter et laver la résine avec du DCM jusqu&#39;à ce que le filtrat devienne incolore. Indication positive est des perles de résine restants orange ou rouge. </li><li> ESSAI CHLORANILE 12: Transfert ~ 1 mg de résine sèche dans un petit flacon par l&#39;intermédiaire d&#39;une pipette jetable. Ajouter 3 gouttes de deux de 0,8 mM dans chloranile solution dans le DMF et de l&#39;acétaldéhyde à 2% en solution dans le DMF et laisser reposer à température ambiante pendant 5-10 minutes. Indication positive est les perles de résine de tournage bleu / violet. </li><li> ESSAI TRAP ACTIVATION: composés activés au cours de la synthèse peut être évaluée par le transfert d&#39;une petite quantité (ul 5-10) de la solution activée à une chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) flacon contenant 50 ul de pyrrolidine. Mélanger à la main pendant quelques secondes (solutidevrait devenir le jaune), puis diluer avec 450 uL de tétrahydrofurane (THF) et de soumettre à analyse LC-MS. </li><li> ANALYSE LC-MS: Le produit final et des intermédiaires activés peuvent être évalués en utilisant une HP série 1200 LC-MS équipé d&#39;un système de Waters Xterra MS C18 3,5 um 4,6 mm x 150 mm colonne et un système de gradient de 5-95% d&#39;acétonitrile dans l&#39;eau avec de l&#39;acide formique 0,1% en 30 minutes. </li></ol> 12. Les résultats représentatifs Un exemple de tant brut (Figure 4) et purifiée (Figure 5) traces LCMS sont fournis. Rendements purifiés d&#39;environ 10% sont attendus en utilisant les méthodes décrites ci-dessus. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de montage expérimental pour la synthèse en phase solide. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figure 2.Nomenclature pertinente du Bis-amino-acides / bis-peptides. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figure 3. Globalement schéma de synthèse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Figure 4a. Trace HPLC du produit brut à 274 nm. <img alt="Figure 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figure 4b. Spectre MS de Peak produit brut. <img alt="La figure 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> La figure 5a. HPLC Trace de produit purifié à 274 nm. <img alt="Figure 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> La figure 5b. Spectre MS de Produc purifiéet Peak.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;approche de synthèse présenté ci fournit un procédé pour la synthèse de peptides fonctionnalisés bis-bis-aminés à partir des blocs de construction d&#39;acide à l&#39;aide communs en phase solide des techniques de synthèse des peptides. La synthèse du monomère de ces «blocs de construction&quot; Pro4 de trans-4-hydroxyproline 3 est hautement évolutive et a été complété avec succès à la scène lors d&#39;une hydantoïne mmol 600 (234 g) échelle (non publié). Une fois que les monomères sont dans la main, l&#39;utilisation de techniques en phase solide fournit une méthode plus rapide de bis-peptide de synthèse que notre actuelle phase solution la méthodologie 4 en éliminant la nécessité d&#39;une réaction de travail-ups et les purifications intermédiaires. Le principal défi de synthèse en phase solide est le diagnostic des progrès synthétique et la résolution de problèmes étant donné qu&#39;aucun des intermédiaires sont isolés. Ceci a conduit à la mise au point de nombreux tests colorimétriques y compris ceux de déterminer si des amines libres (Kaiser essai 10) ou sans hydroxydeYLS (rouge de méthyle essai 7) sont exposés sur la résine. Malheureusement, le test couramment utilisé Kaiser 10 n&#39;est pas généralement applicable dans notre synthèse en phase solide en raison de l&#39;utilisation presque exclusive des amines secondaires ou des amines attachés à un atome de carbone quaternaire. D&#39;autres options pour l&#39;évaluation de résine HMBA comprennent clivages de test en utilisant un nucléophile tel que l&#39;hydrazine 11, quantitative clivage Fmoc surveillé par UV / Vis 1,11, et le piégeage et l&#39;analyse des composés entrants activés. Une autre question négligée dans synthèse en phase solide est le caractère répétitif des étapes de synthèse requises par l&#39;opérateur. Avec cela à l&#39;esprit, les auteurs recommandons fortement l&#39;utilisation d&#39;un tableur ou une liste lorsqu&#39;il exerce une synthèse peptidique en phase solide manuel. La difficulté dans l&#39;utilisation de bis-peptides pour synthèse en phase solide par rapport à α communs acides aminés comprend le potentiel de plus difficile en raison de couplages stérique hinDrance, la nécessité pour les fermetures dicétopipérazines sur résine, et déprotections simultanées (BOC / tBu; Cbz / tBu). Une autre réside dans la réalisation difficilement libération quantitative de la résine à l&#39;aide de cette &quot;cran de sûreté&quot; méthode par rapport à des moyens plus conventionnels. Avec ces facteurs à l&#39;esprit, il est très possible que l&#39;optimisation de ce procédé peut être réalisé et les efforts actuels sont en cours dans notre groupe pour améliorer la méthode présentée ici.

<table border="1"><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> HMBA-Am Résine </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Toxique, Corrosif </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Cancérigène </td></tr><tr><td> DCM anhydre </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Cancérigène </td></tr><tr><td> Bromure d&#39;hydrogène 33% dans l&#39;acide acétique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Toxique, Corrosive, fumées lorsqu&#39;il est ouvert </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Inflammable, toxique, corrosif </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Inflammable, toxique </td></tr><tr><td> DMF anhydre </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Inflammable, toxique </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Inflammable, toxique, corrosif </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Toxique, Corrosif </td></tr><tr><td> CONSEILS </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Inflammable, toxique </td></tr><tr><td> Pipéridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Inflammable, toxique, corrosif </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxique </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Toxique </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Toxique </td></tr><tr><td> Rouge de méthyle </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Inflammable, toxique, le peroxyde de formage </td></tr><tr><td> Pyrrolidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Inflammable, toxique, corrosif </td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde </td><td> Pêcheur </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> Réacteurs SPPS </td><td> Grâce </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> 1200 Series </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> Série 1100 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Lyophiliseur </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> Argon </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

En 1962, RB Merrifield a publié la première procédure en utilisant la synthèse peptidique en phase solide comme une nouvelle voie pour synthétiser efficacement des peptides. Cette technique s&#39;est rapidement avéré avantageux par rapport à sa solution en phase prédécesseur dans le temps et le travail. Améliorations concernant la nature du soutien solide, les groupes protecteurs employés et les méthodes de couplage utilisées au cours des cinq dernières décennies n&#39;ont fait qu&#39;accroître l&#39;utilité du système d&#39;origine Merrifield. Aujourd&#39;hui, l&#39;utilisation d&#39;une protection Boc-base et base / nucléophile stratégie de résine Fmoc-clivable ou une protection basée sur la stratégie de résine et acides clivable, mis au point par RC Sheppard, sont le plus couramment utilisé pour la synthèse de peptides 1. Inspiré par Merrifield stratégie soutenue solide, nous avons développé une stratégie Boc / tert-butyle synthèse en phase solide pour l&#39;assemblage des fonctionnalisés bis-2 peptides, qui est décrite ici. L&#39;utilisation de synthèse en phase solide par rapport to solution en phase méthode n&#39;est pas seulement avantageuse dans le temps et active telle que décrite par une Merrifield, mais permet également une plus grande facilité dans la synthèse de bis-peptidiques bibliothèques. La synthèse que nous démontrons ici intègre un stade clivage final qui utilise un en deux étapes &quot;cran de sûreté&quot; mécanisme pour libérer le bis-fonctionnalisé peptide de la résine par la formation de dicétopipérazine. Bis-peptides sont rigides, des spiro-échelle oligomères de bis-acides aminés qui sont aptes à placer la fonctionnalité d&#39;une manière prévisible et désignable, commandé par le type et la stéréochimie des unités monomères et de la connectivité entre chaque monomère. Chaque acide aminé est le bis-une stéréochimiquement pur, cyclique échafaudage qui contient deux acides aminés d&#39;un acide carboxylique avec une α-aminé) 3,4. Notre laboratoire étudie actuellement le potentiel de bis-fonctionnels des peptides à travers une grande variété de domaines, y compris la catalyse, interactions protéine-protéine et nanomaterials.

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

La synthèse peptidique en phase solide efficace d&#39;un peptide bis-fonctionnalisé trimère utilisant un &quot;cran de sûreté&quot; procédure de clivage de la résine HMBA est décrite.

Synthèse en phase solide d&#39;un bis-fonctionnalisé peptide en utilisant &quot;Sécurité Catch&quot; Méthodologie

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.4K vues.  Temple University. La synthèse peptidique en phase solide efficace d'un peptide bis-fonctionnalisé trimère utilisant un "cran de sûreté" procédure de clivage de la résine HMBA est décrite.

Vidéo: Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Optimisation de la réaction de Ugi utilisant la synthèse parallèle et automatisé de manipulation des liquides

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

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Biologie

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthèse et d&#39;étalonnage des nanosondes phosphorescent pour l&#39;imagerie oxygène dans les systèmes biologiques

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solide plaque à base de restriction alimentaire Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Méthodologie d&#39;essai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Un essai en phase liquide d&#39;affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthèse de la longueur d&#39;onde de décalage d&#39;ADN à l&#39;aide de sondes d&#39;hybridation cyanine photostable

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

Analyses de la maladie de la pourriture des racines sèches chez les pois chiches : une méthodologie détaillée

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

Synthèse hétérocyclique spinocyclique fonctionnalisée et dosage de cytotoxicité

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Isolement et analyse de vésicules extracellulaires traçables et fonctionnalisées à partir du plasma et des tissus solides

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2&#039;-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

Détermination de la durée de la phase S à l’aide de l’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine chez Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...