Une technique courante pour découvrir la fonction d’une protéine est de la supprimer et de voir ce qui se passe. Mais vous ne pouvez pas le faire avec une protéine essentielle. C’est essentiel, la cellule meurt.
Donc, vous avez besoin d’un moyen d’enlever cette protéine et d’attraper un aperçu de ce qui se passe juste avant la mort cellulaire. L’épuisement des protéines doit être rapide, de sorte que vous n’obtenez pas d’effets secondaires. Il doit être spécifique, de sorte que seule cette protéine est enlevée et seulement épuisée quand vous voulez qu’elle soit.
Et il ne devrait pas affecter la cellule d’une autre manière autre que l’élimination de cette protéine. Après avoir préparé la souche, utilisez une culture du jour au lendemain pour déterminer quelle dilution est nécessaire. Utilisez ces informations pour mettre en place une nouvelle culture suffisante avec un OD600 entre 0,1 et 0,2, et la cultiver à 30 degrés Celsius.
Dans une hotte de fumée, ajouter un méthanol équivalent à 30 à 50 % du volume prévu de l’échantillon à un tube de 15 millilitres. Fermez bien les tubes, étiquetez-les et placez-les sur de la glace sèche pour les refroidir. Ensuite, étiquetez les tubes de 1,5 millilitre pour l’entreposage à long terme des échantillons et placez-les sur de la glace pour les refroidir.
Refroidir au moins un millilitre d’eau par échantillon sur la glace. Une fois que la densité optique cible pour le début de la pré-incubation a été atteinte, transférez un échantillon dans le tube pré-préparé contenant du méthanol froid. Inverser brièvement le tube et le remettre sur la glace sèche.
Il s’agit de l’échantillon de contrôle non induit. Immédiatement, ajouter le bêta-estradiol de sorte que la concentration finale est de 10 micromolaires. Tourbillonner vigoureusement pour mélanger.
Continuez à développer la culture comme avant, en couveant avec du bêta-estradiol pour le moment optimal tel que décrit dans le protocole de texte. Le temps d’incubation bêta-estradiol est l’étape la plus importante et doit être optimisé pour chaque protéine. Trop court et l’épuisement est incomplet et lent.
Trop longtemps et les niveaux de protéines vont baisser avant même d’avoir ajouté l’auxin. Pipette jusqu’à 0,5 microlitres d’IAA par millilitre de culture à ajouter plus tard. Recueillir un échantillon de la culture non épuisée comme décrit précédemment.
Ajouter immédiatement l’IAA à une concentration finale de 750 micromolaires et tourbillonner vigoureusement pour mélanger. Démarrez une insurité dès que possible après le mélange. Prélever des échantillons selon la conception expérimentale.
Ensuite, placez les échantillons sur la glace. Assurez-vous qu’aucun des échantillons n’a gelé. Le cas échéant, réchauffez-les doucement dans la main tout en les inversant constamment.
Une fois que tous les échantillons sont prélevés et non congelés, centrifugez-les à 3 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Verser le méthanol et le mélange moyen et remettre les échantillons sur la glace. Ensuite, resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre d’eau et transférez cette suspension dans un tube étiqueté sur la glace.
Centrifugeuse brièvement à une vitesse supérieure à 15 000 fois G pour répulsif les cellules. Après cela, remettre les tubes sur la glace et aspirer le liquide. Dans cette étude, la dégradation est réglée pour atteindre l’épuisement spécifique et efficace de protéine sans affecter autrement le métabolisme de la cellule de levure.
Les protéines Prp2 et Prp22 épissosomales à faible abondance sont toutes deux épuisées à moins de 20 % après 20 minutes de pré-incubation avec bêta-estradiol, suivies de 15 minutes avec auxin. Des temps de pré-incubation plus longs conduisent à un appauvrissement plus rapide, mais montrent également un épuisement indésirable des protéines avant l’ajout d’auxin. En comparaison, le Dcp1 le plus abondant n’est épuisé qu’à environ 30% avec le même traitement.
Cependant, 60 minutes de temps de pré-incubation se traduit par l’épuisement à 13% avec le même traitement auxin au coût de l’épuisement avant l’auxin est ajouté. Optimisez le temps de pré-incubation, et ne perdez pas la trace du temps entre vos points de temps. Ce qu’il faut faire ensuite dépend de votre question.
Nous avons constaté que l’échantillon de culture de 10 millions de mils est suffisant pour l’analyse des protéines, de l’ADN ou de l’ARN. La procédure d’échantillonnage est également facilement adaptable pour chip. Maintenant, il existe un moyen rapide et spécifique d’épuiser les protéines.
Ainsi, la fonction même des protéines essentielles peut être trouvée. Le protocole est assez sûr. Le méthanol est le seul produit chimique dangereux.
Prenez soin de le distribuer. Faites-le dans une hotte de fumée, et porter deux paires de gants, comme le méthanol peut passer à travers la plupart des gants nitrile.
