Cette recherche a été financée par des subventions en aide pour les jeunes scientifiques (A) (# 16680015), Grant-in-Aid pour la recherche exploratoire (# 16653065), Grant-in-Aid pour la recherche scientifique sur les zones prioritaires (# 18023022, # 18016012 et # 18053015) du ministère de l&#39;Éducation, Culture, Sports, Science et Technologie au Japon, Grant-in-Aid de promotion des études fondamentales en sciences de la santé de l&#39;Institut national de l&#39;innovation biomédicale (NIBIO), Grant-in- L&#39;aide de neuroinformatique Japan Center (NIJC), RIKEN

<ol><li> L&#39;appareil utilisé pour le test de la transition jour / nuit se composait d&#39;une cage (21x42x25 cm) divisé en deux sections de taille égale par une cloison avec porte (Ohara &amp; Co., Tokyo). </li><li> Les souris sont logées trois à quatre par cage dans une pièce avec un 12 h cycle lumière / obscurité (lumières à 07h00) avec un accès ad libitum à la nourriture et l&#39;eau. Idéalement, deux contrôles et deux mutants sont logés ensemble, en réorganisant les souris dès qu&#39;ils sont génotypés au moment du sevrage. Tests comportementaux est réalisée 09h00-18h00 Tous les cages contenant les souris sont transférés à la salle de test de comportement 30 min avant le premier procès commence. </li><li> Une chambre est brillamment éclairé par diodes blanches (390 lux), tandis que l&#39;autre chambre est sombre (2 lux). Les souris sont placées dans le côté sombre et la porte est ouverte automatiquement 3 secondes après que la souris est détecté par la caméra infrarouge. La porte est utilisée afin que les souris ne pénètrent dans la chambre de lumière immédiatement après la libération de leur motivation à sortir de l&#39;expérimentateur, depuis le temps de latence pour entrer dans la chambre de lumière peut servir d&#39;indice d&#39;anxiété comportement semblable. </li><li> Les souris sont autorisés à circuler librement entre les deux chambres avec la porte ouverte pendant 10 min. L&#39;application utilisée pour l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données comportementales (Image LD4) est basé sur le programme J domaine de l&#39;image publique (développé byWayne Rasband à l&#39;Institut national de santé mentale et disponible à http://rsb.info.nih.gov/ij /), qui a été modifié par Tsuyoshi Miyakawa (disponible par O&#39;Hara &amp; Co., Tokyo, Japon). </li><li> La distance parcourue dans chaque chambre, le nombre total de transitions, le temps passé dans la chambre de chacun, et le temps de latence pour entrer dans la lumière chamberare enregistrées par image LD4 programme. </li><li> Après chaque essai, toutes les chambres sont nettoyées avec de l&#39;eau hypochloreux super pour éviter un biais basée sur les signaux olfactifs. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

Toutes les procédures ont été approuvées par l&#39;utilisation des animaux et du Comité des soins Université de Kyoto. Tsuyoshi Miyakawa est associée à BIRD, le Japon science et la technologie de l&#39;Agence, Saitama, au Japon.

Bien que toutes les séquences du génome de la souris ont été déterminés, les fonctions de la plupart de ces gènes ne sont pas connus. Gene-techniques de ciblage, cependant, peut être utilisé pour supprimer ou manipuler un gène spécifique chez la souris (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004).. L&#39;influence d&#39;un gène donné sur un comportement spécifique peut alors être déterminée par des analyses comportementales des souris mutantes (Takao et Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Comme un test de phénotypage comportemental de souris mutantes, le test de la transition jour / nuit est l&#39;un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l&#39;anxiété comme le comportement des souris (Crawley, 2000). Le test est basé sur l&#39;aversion naturelle des souris à l&#39;éclat zones éclairées et sur leur comportement exploratoire spontanée dans de nouveaux environnements (Crawley, 1985). Le test est sensible à un traitement anxiolytique (Crawley, 1985). L&#39;appareil se compose d&#39;une chambre noire et d&#39;une chambre brillamment illuminé. Une ouverture restreinte, 3 cm de haut par 5 cm de large, relie les deux chambres. Les souris sont autorisés à circuler librement entre les deux chambres. Le nombre d&#39;entrées dans la chambre lumineuse et la durée du temps passé là-bas sont utilisés comme des indices de brillantes espace d&#39;anxiété chez la souris. Le test de transition clair / sombre a été initialement développé par Crawley et ses collègues (Crawley et Goodwin, 1980). Il ya deux différences entre leur version originale et de notre test. Tout d&#39;abord, la chambre de la lumière est plus grande que la chambre noire dans la version originale, tandis que la taille des deux chambres est le même dans notre version d&#39;essai. Deuxièmement, dans la version originale, la chambre n&#39;avait pas de lumière au plafond et les murs de la chambre de la lumière ont été transparentes (Crawley et Goodwin, 1980), tandis que nous utilisons en plastique opaque blanc pour le plafond et les murs de la chambre de lumière. Ces différences, à savoir la taille et l&#39;ouverture de la chambre de la lumière, permettant la détection simultanée de l&#39;espace lumineux-anxiété ainsi que l&#39;espace ouvert d&#39;anxiété dans la version originale du test. Dans notre laboratoire, cependant, l&#39;espace ouvert comme le comportement d&#39;anxiété chez la souris est testé dans un labyrinthe surélevé. Les parois opaques et le plafond, la taille de la chambre de la lumière, et notre lumière spécifique / sombre protocole d&#39;essai de transition est plus spécialisé pour la détection de l&#39;espace-vives inquiétudes par rapport à la version originale. Bien que le test de transition lumière / obscurité et surélevé labyrinthe sont tous deux utilisés pour évaluer l&#39;anxiété comme le comportement, les résultats ne sont pas toujours cohérentes. Par exemple, prosencéphale spécifiques des souris knockout calcineurine passer une diminution de la quantité de temps dans la chambre de la lumière dans le test de la transition jour / nuit, mais une quantité accrue de temps dans les bras ouverts dans le labyrinthe surélevé (Miyakawa et al., 2003) . Nous avons supposé que notre lumière / test de transition sombre et tests de labyrinthe surélevé d&#39;évaluer les différents aspects de l&#39;anxiété comme le comportement, tels que l&#39;espace lumineux-anxiété et l&#39;angoisse open-space-like comportement. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé un grand ensemble de données recueillies à l&#39;aide de la souris même dans les deux essais. Dans notre laboratoire, nous effectuons des batteries de tests comportementaux qui couvre de nombreux domaines à l&#39;écran pour la signification du comportement des gènes. La batterie de tests nécessite plusieurs semaines à compléter. Pendant la période d&#39;essai, cages à souris sont conservés sur un support dans nos installations. Si les souris sont transportés à notre laboratoire à partir d&#39;autres institutions, ils sont habitués à l&#39;environnement de notre établissement pendant au moins 1 semaine. Après la période d&#39;accoutumance, les souris sont soumises à un contrôle de santé général et le dépistage neurologique (Miyakawa et al., 2003), et après ces examens simples, les souris sont soumises à l&#39;épreuve de transition jour / nuit. L&#39;essai est effectué dans une chambre insonorisée expérimentale après 30 minutes d&#39;accoutumance à la salle d&#39;expérimentation, comme montré dans le film. Nous avons évalué plus de 60 souches de souris mutantes transgéniques en utilisant le protocole indiqué dans le film et ont un grand ensemble de données brutes de plus de 3000 souris (y compris de type sauvage et des souris mutantes). Nous avons effectué des analyses des facteurs de profiter de l&#39;ensemble important de données brutes. En effet, nous avons détecté des facteurs différents de chaque essai (données non publiées), bien qu&#39;il y avait quelques corrélations significatives entre les indices (données non publiées) .. Ces données seront communiquées dans le cadre d&#39;une base de données publique que nous sommes en train de construire. Dans notre batterie de tests, sœurs de type sauvage sont généralement utilisées comme contrôle. Comme une souche de fond, des souris C57BL/6J sont couramment utilisés. Nous avons recueilli les données de la souris C57BL/6J utilisé comme un contrôle de souris mutantes dans la batterie de tests. Les indices obtenus à partir de souris C57BL/6J dans notre test de la transition jour / nuit sont les suivantes (n = 795, moyenne SEM), distance parcourue: 846.5 8.88 cm dans la chambre de la lumière, 1478,5 9,53 cm dans la chambre noire, la durée du temps passé : 215,8 1,85 s à la lumière, 395,8 1,86 s dans l&#39;obscurité; nombre de transitions entre les différents compartiments: 30,52 0,43; de latence pour entrer dans la chambre de la lumière: 64,94 2,40 s. Mouvement de la souris autour de l&#39;entrée aux chambres est détecté par la caméra et il est compté comme du temps passé dans les deux cHambers. Pour cette raison, la somme de la durée moyenne du temps passé à la lumière et que dans les compartiments de foncé a été supérieure à celle de toute la durée de l&#39;épreuve (600 s). Dans notre protocole, une souris est d&#39;abord placé dans la chambre sombre. Trois secondes après avoir placé la souris dans la chambre noire, la porte entre les chambres s&#39;ouvre automatiquement et la souris peut se déplacer librement entre les deux chambres. Souris C57BL/6J passer moins de temps dans la chambre de la lumière que dans la chambre noire (p &lt;0,0001, la durée, si le temps passé à la lumière: 215,8 1,85 s, la durée du temps passé dans l&#39;obscurité: 316.3 2.11 s [le temps passé dans l&#39;obscurité ne comprennent pas le temps initial passé dans l&#39;obscurité avant d&#39;entrer dans la chambre de la lumière pour la première fois], n = 795, jumelé t-test). Cela indique que des souris C57BL/6J ont tendance à éviter la chambre de lumière, et que le temps passé à la lumière est un bon indice de l&#39;anxiété comme le comportement. Les résultats obtenus à partir de différentes souches de souris mutantes sont facilement comparables, car toutes les données sont obtenues en utilisant le même protocole. Pour obtenir des résultats de phénotypage d&#39;une souche de souris mutantes qui peuvent être facilement reproduits et comparés avec les données des autres mutants, les méthodes d&#39;essai de comportement doivent être aussi identiques que possible entre les laboratoires. Crabbe et ses collègues ont testé l&#39;interaction entre le comportement de la souris et l&#39;environnement de laboratoire en utilisant exactement les mêmes souches consanguines et une souche mutant nul. Dans leur étude, les appareils, les protocoles de test, et de nombreuses variables environnementales ont été rigoureusement standardisées. En dépit de la normalisation, ils ont trouvé des différences systématiques dans le comportement des différents laboratoires, mais ils ont aussi décelé des différences de contrainte dans tous les comportements (Crabbe et coll., 1999). Ils ont rapporté que les variables incontrôlables et des expériences qui caractérisent les mutants peuvent donner des résultats qui sont idiosyncrasiques à un laboratoire particulier. Les différences de procédure qui existent entre les laboratoires, il est difficile de reproduire ou de comparer les résultats entre les laboratoires. Ici, nous présentons notre protocole pour le test de la transition jour / nuit comme un film de sorte que les détails du protocole peut être démontrée. Etablir la documentation visuelle du protocole facilitera une meilleure compréhension des détails des procédures expérimentales, permettant la normalisation des protocoles utilisés dans les laboratoires et pour la comparaison des phénotypes comportementaux des différentes souches de souris mutantes évaluée à l&#39;aide de ce test. Films d&#39;autres protocoles, comme pour le labyrinthe surélevé, essai sur le terrain ouvert, test de Porsolt nage forcée, conditionnement de la peur, que nous utilisons dans notre batterie de tests comportementaux sont actuellement en cours pour la publication en tant que futurs articles de revue vidéo.

light/dark transition test for mice

Bien que toutes les séquences du génome de la souris ont été déterminés, nous ne savons pas encore les fonctions de la plupart de ces gènes. Gene-techniques de ciblage, cependant, peut être utilisé pour supprimer ou manipuler un gène spécifique chez la souris. L&#39;influence d&#39;un gène donné sur un comportement spécifique peut alors être déterminée par des analyses comportementales des souris mutantes. Comme un test de phénotypage comportemental de souris mutantes, le test de la transition jour / nuit est l&#39;un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l&#39;anxiété comme le comportement des souris. Le test est basé sur l&#39;aversion naturelle des souris à l&#39;éclat zones éclairées et sur leur comportement exploratoire spontanée dans de nouveaux environnements. Le test est sensible à un traitement anxiolytique. L&#39;appareil se compose d&#39;une chambre noire et d&#39;une chambre brillamment illuminé. Les souris sont autorisés à circuler librement entre les deux chambres. Le nombre d&#39;entrées dans la chambre lumineuse et la durée du temps passé il ya des indices de brillantes espace d&#39;anxiété chez la souris. Pour obtenir des résultats de phénotypage d&#39;une souche de souris mutantes qui peuvent être facilement reproduits et comparés avec ceux des autres mutants, les méthodes d&#39;essai de comportement doivent être aussi identiques que possible entre les laboratoires. Les différences de procédure qui existent entre les laboratoires, toutefois, il est difficile de reproduire ou de comparer les résultats entre les laboratoires. Ici, nous présentons notre protocole pour le test de la transition jour / nuit comme un film de sorte que les détails du protocole peut être démontrée. Dans notre laboratoire, nous avons évalué plus de 60 souches de souris mutantes en utilisant le protocole indiqué dans le film. Ces données seront communiquées dans le cadre d&#39;une base de données publique que nous sommes en train de construire. Visualisation du protocole facilitera la compréhension des détails de l&#39;ensemble de la procédure expérimentale, permettant de standardisation des protocoles utilisés dans les laboratoires et la comparaison des phénotypes comportementaux des différentes souches de souris mutantes évaluée à l&#39;aide de ce test.

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Light/dark Transition Test for Mice

Le test de la transition jour / nuit est l&#39;un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l&#39;anxiété comme le comportement des souris. Ici, nous présentons un film qui montre des procédures détaillées sur la façon dont nous menons le test.

Test de transition clair / foncé pour souris

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

51.7K vues.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. Le test de la transition jour / nuit est l'un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l'anxiété comme le comportement des souris. Ici, nous présentons un film qui montre des procédures détaillées sur la façon dont nous menons le test.

Vidéo: Light/dark Transition Test for Mice

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Elevated Maze Plus pour Souris

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Recherche

Biologie

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Modèle murin de la maladie de Parkinson: de lésion dopamine 6-OH au test comportemental

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un allèle spécifique Assay expression du gène pour l&#39;épreuve la base fonctionnelle des associations génétiques

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.