This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. Préparation de la membrane basale Matrix et Revêtement de Plasticware <ol><li> Placez le congelé membrane basale matrice stocks de -20 ° C sur de la glace et décongeler une nuit à 4 ° C. </li><li> Après décongélation, la pipette des parties aliquotes de 2 mg matrice de membrane basale dans des tubes Eppendorf pré-réfrigérés. Stocker ces à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Pour préparer des plaques de matrice revêtu la membrane basale, dégeler une aliquote sur la glace jusqu&#39;à ce que le dernier morceau de glace dans les disparaît tube Eppendorf (généralement dans ~ 2 h). </li><li> Après décongélation, ajouter matrice de membrane basale de 12 ml de froid (4 ° C) du milieu DMEM / F12 pour faire une solution de revêtement de la matrice de membrane basale. </li><li> Ajouter la solution de matrice de membrane basale dans le récipient de culture approprié. Pour une plaque à 6 puits, distribuer 1 ml par puits. Agiter la plaque pour se assurer que la solution de la matrice de la membrane basale couvre complètement chaque puits. </li><li> Parafilm sceller la membrane basale matrice plaque revêtue / plat, et incuber à room température pendant 1 heure avant utilisation. Alternativement, plaques de matrice revêtu de la membrane basale du magasin / plats à 4 ° C et utiliser dans les 2 semaines de revêtement. REMARQUE: Ajout frais de DMEM / F12 pour la membrane basale matrice plaque revêtue / plat pour éviter le dessèchement. Avant d&#39;utiliser 4 ° C membrane basale stockée matrice plaque revêtue / plat, placez-le dans une enceinte de sécurité biologique et de lui permettre de revenir à la température ambiante pendant au moins 30 min. </li><li> Aspirer matrice de membrane basale complètement avant l&#39;addition de milieu et de cellules. </li></ol> 2. Préparation du milieu E8 <ol><li> Préparer un milieu de culture en décongelant E8 E8 supplément pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer 10 ml de E8 milieu de base de la 500 ml stock et le jeter. </li><li> Pipeter l&#39;ensemble flacon de 10 ml de supplément E8 directement dans 490 ml de milieu de base E8. Avez moyenne E8 complète pas chaud dans un bain-marie à 37 ° C, que les fluctuations de température répétées peuvent dégrader le bFGF dans l&#39;achèvementmoyenne te E8. </li><li> Utilisez milieu complet E8 dans les 2 semaines de plus du supplément. </li></ol> 3. Le dégel des CSPi <ol><li> Retirer un flacon de CSPi congelés de l&#39;azote liquide et le placer sur la glace sèche. </li><li> Décongeler rapidement le flacon dans un bain d&#39;eau à 37 ° C; agiter le flacon dans le bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que seule une infime fragment de restes de glace. </li><li> Vaporisez le flacon avec 70% d&#39;éthanol et le transfert à une enceinte de sécurité biologique. </li><li> Ajouter 1 ml de la température ambiante, goutte à goutte E8 milieu directement dans le flacon. </li><li> Utilisation d&#39;une pipette 2 ml, goutte à goutte de transférer la suspension de cellules dans 9 ml de milieu E8 dans un tube conique de 15 ml. Agiter le tube fréquemment pour se assurer que les cellules et le milieu bien mélanger rapidement. </li><li> Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume approprié de E8 supplémenté avec 10 pM de Y-27632. </li><li> Ajouter les cellules à un nombre approprié de sous-sol membrane matrice puits revêtus, et placer dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur nuit. Il est recommandé à l&#39;assiette au moins 0,2 x 10 6 iPSC par puits d&#39;une plaque à 6 puits pour permettre la récupération rapide après décongélation. </li></ol> 4. Maintenance et repiquage systématique des CSPi <ol><li> Actualiser moyenne quotidienne E8. </li><li> Surveiller la morphologie et la confluence de cellules avec un microscope inversé. CSPi de haute qualité dans les colonies grandissent plats avec des aréoles distinctes; colonies individuelles possèdent une apparence &quot;pavée-like&quot;. </li><li> Passage des cellules CISP quand ils atteignent ~ 70% de confluence. </li><li> Préparer une solution EDTA de passages en ajoutant 0,9 g de NaCl et 500 pi d&#39;EDTA 0,5 M à 500 ml DPBS. Mélangez bien pour dissoudre NaCl, et le filtre à vide à stériliser. Chauffer une partie aliquote de la solution de passages dans un bain d&#39;eau à 37 ° avant le repiquage. </li><li> Au passage, aspirer passé milieu de culture et laver les cellules une fois avec un volume égal de pas chaudssaging solution. Aspirer et pipette assez EDTA solution de passages pour enrober les cellules (1 ml par puits d&#39;une plaque à 6 puits). </li><li> Placez les cellules sous un microscope inversé et observer les colonies iPSC. L&#39;apparition de trous dans les colonies et des frontières soulevées devrait devenir apparente dans les 2-5 min. </li><li> Aspirer soigneusement la solution EDTA de passages. </li><li> En utilisant une pipette de 10 ml, passer 4 ml de milieu E8 (si vous utilisez une plaque de 6 puits) sous haute pression directement dans chaque puits pour être repiquées. </li><li> Recueillir les touffes iPSC, et divisée en un nombre approprié de puits selon le rapport de division de 1: 8 à 1:12. Ne pas trop-pipette, que la désagrégation des amas de cellules entraînera faible viabilité. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur, et basculer la plaque de va-et-vient et côte à côte plusieurs fois pour disperser les cellules. </li></ol> 5. Préparation du MEF et CSPi pour Tansfection <ol><li> 48 heures avant la transfection, CSPi de passage à ~ 1: 6 en quatre ou plusieurs puits d&#39;une matrice revêtu plaque de 6 puits membrane basale, de sorte qu&#39;ils seront 70% de confluence dans deux jours. </li><li> Le lendemain, décongeler DR4 MEF MEF dans le milieu constitué de DMEM (glucose élevé) complété avec 10% de FBS et 1x MEM-NEAA. </li><li> Plate DR4 MEF en deux plats de 10 cm à 2 x 10 ~ 4 cellules / cm 2 et incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Le jour de la transfection, changer MEF à E8 milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 30 min avant d&#39;effectuer la transfection sur iPSCs. </li><li> Facultatif: Si l&#39;analyse de cytométrie en flux de post-transfection CSPi est désiré, retirer une matrice-plaque revêtue de la membrane basale de 4 ° C et le lieu à la température ambiante. </li><li> Facultatif: 4 h avant la transfection, compléter pré-transfection de la culture avec COPSi Y-27632 à la concentration finale de 10 uM. </li></ol> 6. brise-cellule de dissociation de traitement réactif Ae transfection de CSPi l&#39;aide d&#39;un système d&#39;électroporation <ol><li> Retirer P3 solution de transfection de cellules primaires de 4 ° C et lui permettre de revenir à la température ambiante pendant ~ 30 min. Ajouter la totalité du supplément de 100 ul de la solution de transfection avant utilisation. </li><li> Douce et chaude cellules réactif de dissociation dans un bain d&#39;eau à 37 C °. </li><li> Obtenir AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 et PZT-AAVS1-R1) et AAVS1-CAG-EGFP donateurs de -20 ° C. </li><li> Retirer CSPi de l&#39;incubateur et laver une fois avec du DPBS. </li><li> Ajouter 1 ml de douce-cellulaire réactif de dissociation par puits, et incuber CSPi à 37 ° C pendant 5 minutes, ou jusqu&#39;à ce que plus de 50% des cellules ont dissocié du récipient de culture. </li><li> Introduire à la pipette les cellules de haut en bas à quelques reprises à l&#39;aide d&#39;une pipette de p1000 de dissocier toutes les cellules restantes de la cuve de culture, et de briser les mottes iPSC. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu E8 à chaque puits, et pipette de haut en bas plusieurs fois en utilisant une pipette de 10 ml à Fürther désagréger amas de cellules en cellules individuelles NOTE: L&#39;efficacité de transfection diminue significativement si des agrégats cellulaires ne sont pas suffisamment désagrégées. </li><li> Recueillir iPSCs dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 100 g pendant 3 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans une quantité minimale de milieu E8. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre après application d&#39;un colorant vital tel que 0,4% de bleu trypan. Veiller à ce que les cellules sont suffisamment dissociées en comptant (1-3 cellules par &quot;bouquet&quot;). </li><li> Distribuer 3 x 10 6 cellules dans chacun des deux tubes coniques de 15 ml, et centrifuger à nouveau à 100 g pendant 3 min. NOTE: centrifugation à basse vitesse réduit le stress cellulaire et permet facilement remise en suspension des CSPi avant électroporation. </li><li> Réglez le système d&#39;électroporation au programme spécifique de type cellulaire pour la embryonnaires lignée de cellules souches humaines H9 (Programme CB-150). </li><li> Après centrifugation, aspirer le surnageant de la cell pellets. Pour une pastille, ajouter 10 ug du donneur de RH comme échantillon témoin. Pour ajouter l&#39;autre pastille 10 pg du donneur d&#39;HR, avec 5 pg de chaque TALEN (PZT-AAVS1 et PZT-L1-R1-AAVS1) comme échantillon expérimental. </li><li> Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 100 pi de solution de transfection de cellules primaires P3, et la transfère dans une cuvette. </li><li> Effectuer la transfection et ajouter immédiatement 500 ul de milieu de E8 de la température ambiante à chaque cuvette. </li><li> Transférer le CSPi goutte à goutte transfectées à une boîte de 10 cm contenant MEF DR4 préparés à l&#39;étape 5.4. </li><li> Facultatif: ajouter quelques gouttes de chaque expérience dans un puits d&#39;une matrice revêtue plaque à 6 puits membrane basale si ANALYSES cytométrie de flux de l&#39;efficacité de transfection est souhaitée. </li><li> Répétez les étapes 6.15 à 6.17 pour finir les deux échantillons. Le lendemain, laver les cellules avec du DPBS deux fois et basculer milieu de culture pour NutriStem, qui semble soutenir la culture iPSC sur les départs mieux que E8. </li><li> Transient pics d&#39;expression de EGFP dans les 48 à 72 heures après la transfection; évaluer l&#39;efficacité de transfection comme vous le souhaitez. </li></ol> 7. puromycine Sélection des CSPi ciblés <ol><li> Début sélection puromycine 72 heures après transfection lorsque les CSPi atteignent 70% de confluence. </li><li> Pour NCRM5 CSPi, commencer la sélection de la puromycine à 0,5 pg / ml de puromycine (1/2 de la dose complète) dilué dans un milieu de culture NutriStem. La concentration optimale de la puromycine peut varier de 0,25 à 1 ug / mIL pour certaines lignes iPSC. </li><li> CSPi de la culture dans NutriStem + 0,5 pg / ml de puromycine pendant 3 jours, le milieu rafraîchissantes quotidienne. </li><li> Après 3 jours, augmenter la concentration de la puromycine à 1 ug / ml. </li><li> CSPi de Culture de moins de 1 ug / ml de sélection puromycine pendant 7-8 jours, ou jusqu&#39;à colonies distinctes apparaissent assez grand pour la cueillette colonie. </li></ol> 8. prélèvement de colonie et expansion des CSPi ciblées <ol><li> Utilisez membrane basalematrice pour revêtir une plaque de 96 puits en distribuant 50 ul d&#39;une solution de revêtement de la matrice de membrane basale (2 mg matrice de membrane basale dilué dans 12 ml de DMEM / F12) dans chaque puits. Conservez la plaque à 4 ° C pendant la nuit avant de l&#39;utiliser. </li><li> Après avoir laissé la plaque de matrice revêtu membrane basale à venir à la température ambiante, aspirer la matrice de la membrane basale et distribuer 100 pi E8 complété avec 10 uM Y-27632 dans chaque puits. </li><li> Placez un microscope inversé dans une enceinte de sécurité biologique, et vaporiser légèrement avec 70% EtOH à stériliser. </li><li> Tirez une pipette Pasteur en verre au-dessus d&#39;un bec Bunsen pour obtenir un outil colonie cueillette idéal qui a un «crochet» minuscule à la pointe. Stériliser avec EtOH à 70%, et le placer dans la hotte pour sécher. </li><li> Retirer le plat contenant colonies iPSC ciblées de l&#39;incubateur, et la placer dans la hotte sous le microscope. </li><li> Choisissez CSPi en traçant un cercle autour de la frontière de la colonie avec l&#39;outil de la colonie-picking.</li><li> Utilisez le «crochet» de l&#39;outil colonie-cueillette à gratter délicatement et retirez la colonie iPSC de la surface de la plaque. Pour les grandes colonies, dessinant un X avec l&#39;outil de la colonie-picking à la colonie trimestre facilitera la croissance des cellules après re-placage. </li><li> Une fois amas de cellules sont détachées et flottant librement, utiliser une pipette de p200 mis à ~ 30 pi de recueillir les CSPi. cellules de la plaque directement dans la plaque à 96 puits. </li><li> En option: utiliser une pipette de p20 mis à ~ 5 pi de recueillir les CSPi dans un tube Eppendorf, puis ajouter 50 ul douce cellules réactif de dissociation à digérer pendant 5 min à 37 ° C. Après digestion, ajouter 500 pi de milieu E8 dans le tube Eppendorf pour diluer le réactif de dissociation douce cellules et centrifuger les cellules à 200 xg dans une microcentrifugeuse de table standard pour 5 min. Puis aspirer plus du milieu et de laisser ~ 30 pi Pour resuspendre et transférer les cellules dans la plaque 96 puits. NOTE: Ceapproche facilitera la dissociation de la touffe de la cellule et l&#39;expansion rapide de colonie ramassé. </li><li> Continuer colonie cueillette jusqu&#39;à ce qu&#39;un nombre suffisant de colonies iPSC ont été collectées (environ 20 à 30 colonies par expérience est recommandé). </li><li> Après prélèvement de colonie, placer la plaque 96 puits dans un incubateur pendant la nuit. Rafraîchir avec un milieu complet de E8 le lendemain, et la culture jusqu&#39;à ~ 70% de confluence. </li><li> cellules de passage de la 96 puits dans un 24 puits, puis dans un 6 puits, comme décrit dans les étapes 4.5 à 4.10. NOTE: les volumes de solution d&#39;EDTA et E8 milieu devraient être proportionnellement réduite lors de l&#39;utilisation de plus petites que les puits d&#39;une plaque à 6 puits. </li><li> Évaluer ciblage succès en jonction PCR et l&#39;analyse par transfert de Southern pour confirmer l&#39;intégration de la cassette ciblée et l&#39;absence de vecteurs insérées au hasard 16. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Les étapes les plus critiques pour la génération réussie de AAVS1 Coffre-port ciblées CSPi humaines sont: (1) délivrant efficacement Talen et donateurs plasmides dans CSPi par transfection; (2) optimiser la dissociation des CSPi dans des cellules individuelles avant la transfection et le placage densité après transfection; (3) l&#39;optimisation dose et l&#39;heure de la drogue sélection basée sur la croissance de la ligne iPSC; (4) disséquant soigneusement et choisir colonies ciblées et le transfert à la n...

La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques humaines en cellules souches pluripotentes souches embryonnaires cellulaires comme induites (CSPi) a été découvert par Takahashi et al. En 2007 1. Fibroblastes dermiques humaines transduites avec rétrovirus exprimant quatre facteurs de transcription (Le Yamanaka soi-surnommé facteurs Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, et Klf4) ont été montrés être très similaire à des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) en fonction de la morphologie, la prolifération, l&#39;expression du gène, et l&#39;état épigénétique; surtout, iPSCs sont également capables de se différencier en cellules des trois couches germinales 1. La capacité potentielle et la différenciation de prolifération des CSPi les rend très attractifs outils; par reprogrammation des cellules provenant de patients souffrant de maladies spécifiques, iPSCs peuvent être utilisés à la fois comme systèmes de modèle in vitro de la maladie et en tant qu&#39;agents thérapeutiques potentiels. Pour ce dernier objectif, plusieurs questions doivent être réglées avant que le plein potentiel de CSPidans un cadre clinique peut être réalisé; le potentiel tumorigène des CSEh et CSPi, l&#39;utilisation de dérivés xénogéniques lors de la reprogrammation et l&#39;entretien des cellules cultivées in vitro, et la nécessité de suivre les cellules transplantées in vivo sont tous les obstacles cruciaux à l&#39;application clinique des cellules souches pluripotentes (Commenté par Hentze et au. 2). Une solution idéale pour la nécessité pour le suivi des cellules différenciées post-transplantation impliquerait un marqueur visuellement détectable qui résiste taire et panachées indépendamment de l&#39;application. Expression forte et soutenue de transgènes intégrés est plus facilement réalisable lorsque l&#39;ADN exogène est introduit dans Coffre-port loci; ce est-à emplacements génomiques qui permettent la transcription suffisante d&#39;un vecteur intégré en même temps l&#39;atténuation des perturbations de l&#39;expression dans trois gènes voisins. Un tel site qui a été très bien caractérisé depuis sa découverte est le virus intégr adéno-associésite ation 1 (AAVS1), dans le premier intron de la protéine phosphatase une sous-unité régulatrice 12C (PPP1R12C) gène. Ce lieu a été démontré non seulement pour permettre l&#39;expression soutenue et robuste de transgènes intégrés dans le temps étendu dans la culture et dans la différenciation in vitro 3, mais aussi pour protéger les gènes de la perturbation de la transcription 4 entourant; les deux éléments sont considérées comme étant dues à la présence d&#39;éléments d&#39;isolateur chromatine endogènes flanquant le site de AAVS1 5. Les progrès dans les outils d&#39;ingénierie des génomes plus juste de la dernière décennie ont grandement facilité la facilité et l&#39;efficacité avec lesquelles les manipulations génétiques dans ne importe quel type de cellule peuvent être atteints. Bien que les expériences réussies début invoqués excessivement faibles niveaux de recombinaison homologue endogène (HR) avec un donneur présenter à atteindre ciblage de gène dans les CES 6,7, l&#39;utilisation des nucléases spécifiques au site, tels que les nucléases à doigts de zinc (de ZFN), qui signitivement induire la recombinaison homologue grâce à la génération d&#39;une rupture d&#39;ADN double brin a considérablement augmenté l&#39;efficacité de ces expériences 8,9. La réorientation des deux transcription activateur comme effecteurs (contes) de plantes pathogène Xanthomonas genres et les cluster régulièrement espacées répétitions palindromiques courts procaryotes (CRISPR) / système Cas9 dans efficaces nucléases de créateurs propres à chaque site a fait le ciblage de gènes dans les cellules souches pluripotentes un accessible et méthodologie possible 10-13. Un article récent décrit une méthode efficace pour l&#39;intégration stable d&#39;une cassette de rapporteur fluorescent vert dans le AAVS1 Coffre-port locus CSPi humaines à l&#39;aide de nucléases TALE (Talens) 14. Ces CSPi ciblées ont maintenu leur fluorescence même après la différenciation dirigé vers les cardiomyocytes et la transplantation dans un modèle de souris de l&#39;infarctus du myocarde (IM), fournissant des preuves solides pour l&#39;utilité de cettede manière stable des cellules souches pluripotentes 14 fluorescent. Pour obtenir des colonies cibles, un procédé de piégeage de gènes a été utilisé dans lequel un épissage accepteur (SA), une séquence de peptide de l&#39;auto-clivage 2A place la puromycine N-acétyl-transférase (PAC) gène sous le contrôle du promoteur PPP1R12C endogène; Ainsi, seules iPSCs qui ont incorporé le donneur d&#39;ADN au locus AAVS1 expriment PAC, les rendant sélectionnable sur la base de la résistance à la puromycine; (Figure 1, 15). Ce protocole détaille les procédures de générer AAVS1-GFP CSPi signalé dans le récent article 14, y compris le processus de transfection CSPi avec TALENs et un donneur de 9,8 kb pour intégrer un fragment d&#39;ADN de 4,2 kb dans le locus AAVS1 Coffre-port, la sélection CSPi basé sur puromycine-résistance, et les colonies de cueillette pour l&#39;expansion clonale. Les techniques décrites ici peuvent être appliqués à de nombreuses expériences d&#39;ingénierie du génome.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1437">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT</td>
			<td style="width:123px;">COMPANY</td>
			<td style="width:123px;">CATALOG #</td>
			<td style="width:603px;">COMMENTS/DESCRIPTION</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Essential 8 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Store basal medium at 4&#176;C. Store supplement at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DR4 MEF 2M IRR - Academic</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6204G</td>
			<td>Store in liquid Nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw at 4&#176;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20&#176;C until needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector Core unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001B</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector X unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001X</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C and warm an aliquot in a 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52637 and 52638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX-750 4 &#215; 750mL Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Une visualisation du protocole est fourni à la figure 2, avec des périodes au cours de laquelle CSPi sont cultivées dans un milieu différent, mis en évidence par soit vert pour E8 ou bleu pour NutriStem. Il est important pour la transfection seulement CSPi de haute qualité; examiner les boîtes de culture tout au long de l&#39;entretien de routine et de vérifier que les cultures iPSC contiennent des colonies distinctes portant principalement une morphologie pavée comme (figure 3A);</stro...

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l&#39;homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.3K vues.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Vidéo: Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Recherche

Biologie du développement

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Cultiver des cellules primaires épithéliales nasales des enfants et des Reprogrammer dans les cellules souches pluripotentes induites

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

Protocole pour la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme dans des cultures mixtes de neurones et Glia pour des tests de neurotoxicité

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

Un modèle de souris chimériques du foie humain de l’hypercholestérolémie utilisant des hépatocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

Base d’ARN reprogrammation des fibroblastes humains de primaires sur les cellules souches pluripotentes induites

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...