La technique permet le diagnostic de confirmation des maladies à prions par la technique PrP tremblante dans les tissus, en analysant les types de tremblante PrP et leur distribution pour évaluer l’écart punitif par rapport au profil connu de dépôt de la tremblante PrP. La technique est standardisée et utilise des anticorps spécifiques contre la tremblante PrP, permettant la visualisation du dépôt de la tremblante PrP dans les tissus. La technique donne également des informations sur la zone neuroanatomique et le type de cellules.
Commencez par placer les lames avec les sections de tissu dans un panier de coloration en acier inoxydable. Faire ressortir le panier dans un bain de xylène. Après trois minutes, retirez et immergez à nouveau le panier.
Pour éliminer le xylène et réhydrater les sections, plongez le panier dans un bain d’éthanol absolu. Après trois minutes, retirez et immergez à nouveau le panier. Sécher les sections à l’air libre avant de les placer dans un bain d’éthanol à 90% pendant une minute.
Ensuite, transférez la section dans un bain d’éthanol à 70% pendant une minute supplémentaire. Pour chaque traitement de bain à l’éthanol, agiter doucement le panier coulissant deux fois et égoutter le panier avant le prochain transfert. Transférer le panier dans un bain d’éthanol à 50% pendant une minute.
Immergez soigneusement les coupes de tissu dans de l’acide formique à 98% à température ambiante pendant 30 minutes. Rincer les sections à l’eau du robinet pendant cinq minutes, puis rincer deux fois à l’eau distillée. Utilisez un contenant de coloration en acier inoxydable dans la chambre de pression remplie de 500 millilitres d’eau distillée pour prétraiter le tampon de citrate 10 millimolaires à 98 degrés Celsius pendant 20 minutes.
À des fins de contrôle de la qualité, placez une section de ruban indicateur d’autoclave adhésif sur le panier pour surveiller la température et la pression. Une fois que l’alarme indique que l’équipement a atteint le temps et la température du programme, immergez le panier avec des diapositives. Ensuite, lancez le programme sur la chambre de pression jusqu’au point de consigne 2 et enregistrez la pression initiale et finale de ce programme.
Pour l’inactivation de la peroxydase endogène, immerger le panier de lames contenant les sections d’échantillon dans un bain de peroxyde d’hydrogène à 3% dans du méthanol pendant 30 minutes. Pont sur les sections sous l’eau courante pendant cinq minutes Après avoir drainé, immergez les sections dans une solution saline tamponnée Tris pendant cinq minutes supplémentaires. Pour l’immunodétection, placer chaque lame sur un support de plaque de couverture disponible dans le commerce pré-humidifié avec une solution saline tamponnée Tris, le côté du tissu faisant face au support et les bords de la glissière coïncidant avec les deux points inférieurs du support.
Assurez-vous d’éviter les bulles d’air. Tenez le porte-diapositive entre le pouce et l’index. Placez un doigt sur la lame d’échantillon et l’autre sur le bas du support, puis placez l’ensemble dans la galerie du système.
Pour vous assurer que l’ensemble est bien assemblé, remplissez le puits entre la lame d’échantillon et le support avec une solution saline tamponnée Tris sans le déborder. À partir de ce point, assurez-vous qu’environ 80 microlitres de solution saline tamponnée Tris doivent être retenus entre le support et la lame. Ne laissez pas sécher les sections.
Diminuer la coloration de fond avant le traitement avec l’anticorps primaire en pré-incubant les échantillons de lame pendant 30 minutes avec 20% de sérum normal de la même espèce que l’hôte anticorps secondaire dans une solution saline tamponnée Tris. Sans laver les sections, appliquer 200 microlitres de la solution d’anticorps primaire directement dans chaque puits du porte-lames et incuber pendant 60 minutes à température ambiante. Pour laver les sections, remplissez les puits avec une solution saline tamponnée Tris et attendez cinq minutes.
Répétez le lavage deux fois. Ensuite, diluer l’anticorps secondaire biotinylé à une concentration de 1 à 200 dans une solution saline tamponnée Tris avec du sérum de cheval à 10%. Réparez le volume requis en fonction du nombre de sections à traiter.
Appliquez 200 microlitres de solution d’anticorps secondaires sur chaque puits du jeu de porte-lames. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, répétez le lavage au sérum physiologique tamponné Tris. Pour l’incubation avec la peroxydase du complexe avidine-biotine, préparer le réactif 30 minutes avant utilisation et appliquer 200 microlitres de solution dans chaque puits du porte-plaque coulissante.
Une fois cela fait, incuber le porte-plaque réglé pendant 30 minutes à température ambiante. Le niveau d’immunomarquage non spécifique chez les animaux témoins atteints d’encéphalopathies spongiformes transmissibles à effets négatifs a été déterminé pour interpréter correctement l’immunomarquage des protéines prions anormales spécifiques. Le marquage non ciblé par les anticorps anti-PrP s’est produit sous forme de coloration intraneuronale discrète des particules fines, de fines ficelles linéaires irrégulières dans la neuropile, de marquage diffus non particulaire dans certaines zones de substance grise et blanche et de marquage cytoplasmique diffus des neurones.
Le tableau résume la description des types de protéines prions anormales immunomarquées observées dans l’encéphalopathie spongiforme bovine, la tremblante classique et atypique et une maladie débilitante chronique des cervidés pour un diagnostic positif et des critères établis pour des résultats négatifs, non concluants et inappropriés. Toutes les étapes sont très importantes. Le pH des solutions et la température ambiante sont des caractéristiques importantes pour le succès de cette technique.
Le développement de l’immunohistochimie pour détecter à la fois la tremblante PrP et le type de cellules peut donner des informations sur chaque cellule impliquée dans la pathogenèse principale.
