The authors thank members of the Shapiro lab and Erin Schrader for comments on the manuscript. The authors acknowledge financial support from: NIH postdoctoral fellowship F32 GM100732 to JMS and NIH grants R01 GM51426 and R01 GM32506 to LS.

1. Synchrony à grande échelle - Optimal pour Western Blot, puces à ADN / ARN-Seq, et d&#39;autres essais intensifs Matériel <ol><li> De un congélateur actions ou une plaque, cultiver un 5 ml O / N de la culture de la souche NA1000 en secouant à 28 ° C dans un milieu PYE. </li><li> Inoculer 0,5 ml des cellules de l&#39;étape 1 dans 25 ml de M2G (tableaux 1-2) et agiter à 28 ° C jusqu&#39;à ce que la culture atteint une DO 600 entre 0,5 et 0,6. </li><li> Ensemencer les cellules dans 1 L de M2G et agiter à 28 ° C. </li><li> Une fois DO600 atteigne 0,5 à 0,6, de confirmer la présence de cellules en utilisant swarmer liquide monté microscopie de phase. Spot 1 pi de cellules sur une lame de verre, couvrir avec une lamelle, et l&#39;image par microscopie de phase. Confirmer la présence de cellules Grouillant en visualisant les cellules de natation rapidement dans la population. </li><li> Spin cellules pendant 15 min à 7 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-10. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 180 ml de M2 ​​froide (tableaux 1-2) et res doucementuspend toutes les cellules en utilisant une pipette sérologique. Jeter cellules faiblement granulés; ce sont des cellules predivisional et harcelées. </li><li> Ajouter 60 ml de solution de silice colloïdale froide (ne oubliez pas de mélanger la suspension de silice colloïdale avant d&#39;ajouter aux cellules) et bien mélanger la suspension cellulaire. </li><li> Verser la suspension de cellules dans 30 ml de huit tubes et centrifuger pendant 30 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. NOTE: Il faut voir deux bandes distinctes; la bande de swarmer est la bande inférieure tandis que les cellules traquées / predivisional sont dans la fourchette supérieure (figure 1B). </li><li> Aspirer soigneusement la bande supérieure et enlever le liquide à ~ 1 cm au-dessus de la bande de swarmer (la bande inférieure). </li><li> (Critique) aide d&#39;une pipette Pasteur, retirez soigneusement la bande de swarmer et la placer dans un tube propre. Pour laver la silice colloïdale, en haut du tube hors M2 avec froid et essorage pendant 10 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. </li><li> Eliminer délicatement le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans 20 ml de M2 ​​froid et centrifugation pendant 10 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. </li><li> La suspension de toutes les pastilles dans 30 ml de M2 froid et mesurer l&#39;OD 600 en utilisant un spectrophotomètre et vierge à l&#39;aide du milieu M2 froid. Enregistrer 1 pl pour l&#39;imagerie de phase pour vérifier swarmer cellules; 90-95% des cellules doit être swarmers. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. Resuspendre les cellules dans 28 ° C M2G moyenne de sorte que le A 600 est ~ 0,3 à 0,4 et commencer agitation à 28 ° C. NOTE: Les rendements typiques sont entre 30 et 60 ml de swarmer culture cellulaire à partir de cellules non synchronisées 1L. </li><li> Commencez à prendre des points de temps (la culture de type sauvage prendra environ 135-140 minutes de diviser) 8,9. A chaque point de temps, de mesurer la DO 600. Vérifiez que la DO 600 après la division est d&#39;environ 2X la DO initiale 600. </li><li> Pour blot ou expression génique essais occidentaux, retirez aliquotes de 1 ml de la culture aux points de temps désirés, ralentit à la vitesse max dans une centrifugeuse de table pendant 30 sec, rapidement décanter ou aspirer le milieu, et le flash geler le culot cellulaire dans l&#39;azote liquide. Stocker les cellules à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse en aval. </li></ol> 2. Synchrony à petite échelle - Optimal pour Microscopie <ol><li> De un congélateur actions ou une plaque, grandir à 5 ml O / N secouant la culture à 28 ° C dans M2G. </li><li> Diluer dans 15 ml de M2G (tableaux 1-2) et de croître jusqu&#39;à la mi-log (DO600 = 0,5-0,6). </li><li> Spin à 6,4 KXG pendant 10 min à 4 ° C dans un rotor JA-20, et de remettre en suspension dans 1 ml froides M2 (tableaux 1-2) et transférer dans un tube à centrifuger de 2 ml. </li><li> Centrifuger à 15 KXG pendant 3 min dans un tube de microcentrifugeuse pour sédimenter les cellules, aspirer le surnageant, le culot a mis sur de la glace, et remettre en suspension dans 900 ul de M2 ​​froid. </li><li> Ajouter 900 pi de PVP froid revêtu silice colloïdale et de spin pendant 20 min à 15 KXG à 4 ° C dans un microTube rocentrifuge. </li><li> (Critique) Aspirer ou une pipette du haut traqué / predivisional bande de cellules et de recueillir le fond swarmer bande dans un nouveau tube. </li><li> Laver les cellules deux fois swarmer dans 1 ml de M2 ​​froid tout en centrifugeant à 15 KXG pendant 3 min. </li><li> Avant l&#39;essorage final, déplacer les cellules dans un 1 ml tube à essai en verre pré-réfrigérés et mesurer la DO 600 de cellules par rapport à une ébauche de M2. </li><li> Reprendre le culot cellulaire final dans 28 ° C M2G à une DO entre 0,3 à 0,4 et secouez cellules / roll à 28 ° C. REMARQUE: Les rendements typiques sont comprises entre 2 et 4 ml de culture de cellules swarmer. </li><li> Pour les expériences de microscopie, au souhaitée points temporels lieu 1 pi de cellules sur un tampon agarose M2G pour l&#39;imagerie. </li></ol>

<ol>
	<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control.">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry.">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space.">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li><li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+bacterial+mitosis:+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation.">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li><li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells.">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li><li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway.">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li><li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus.">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li><li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Caulobacter+crescentus.">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li><li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division.">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li><li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. 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T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein.">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li><li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response,+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication.">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li><li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus.">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li><li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+baby+cell+column:+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle.">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. 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C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus.">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li><li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus.">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179 (2011).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus:+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment.">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The bacterial cell cycle is a fundamental process in life and is important for the study of growth and as a target for next generation antibiotics. Here, we detailed the rapid synchronization procedures for C. crescentus NA1000, a model organism for the study of the bacterial cell cycle and asymmetric cell division. This method is amendable to western blot, gene expression profiling, and fluorescence microscopy assays to investigate the spatiotemporal regulation of the bacterial cell cycle. 
<p class='jove_...

Le cycle cellulaire bactérienne contrôle à la fois la replication du génome et la division des cellules filles. Surtout, comme la résistance aux antibiotiques est une menace croissante pour la santé publique, le cycle cellulaire bactérienne présente une cible inexploitée pour le développement antibiotique. Dans la bactérie Caulobacter crescentus, chaque cycle cellulaire conduit à une division asymétrique, pour donner deux cellules filles des différentes sorts (figure 1A) 1,2. Une cellule fille hérite un flagelle et mobiles tandis que l&#39;autre fille hérite d&#39;une tige et est sessiles. Circuit intégré génétique contrôle la progression du cycle cellulaire et sort de la cellule par régulation de la transcription, phospho-signalisation, et la protéolyse régulée 3. En outre, la réplication chromosomique des cellules filles et de rendement de la séparation simultanées qui contiennent exactement une copie du chromosome 4. Fait important, ces deux types de cellules peuvent être séparés rapidement par colloL&#39;Idéal particule de silice densité centrifugation dans la souche synchronisable NA1000 7.5 permettant l&#39;isolement des cellules swarmer du reste de la population avec des rendements élevés (figure 1B). Isolé swarmer cellules alors procéder de manière synchrone par division cellulaire asymétrique. Ici, nous détaillons le protocole utilisé pour synchroniser Caulobacter souche NA1000. Nous fournissons des protocoles et des conseils de dépannage communes pour deux petite et à grande échelle des synchronisations. Cette procédure expérimentale fournit un outil puissant pour interroger le contrôle spatio-temporelle du cycle cellulaire et Caulobacter destin cellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PVP Coated Colloidal Silica (Percoll)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Colloidal Silica (Ludox AS-40)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">420840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">JA10 Rotor</td>
			<td style="width:71px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">JA20 Rotor</td>
			<td style="width:71px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">334831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferrous Sulfate Chelate Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0720-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:71px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0621-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synchronization of caulobacter crescentus for investigation of the bacterial cell cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronisation donne typiquement deux bandes de cellules (figure 1b): la bande de swarmer, qui a une densité plus élevée, et un / predivisional bande cellulaire pétiole de densité inférieure. Pour assurer des contrôles communs de synchronisation efficace comprennent la surveillance de l&#39;OD 600 et de mesurer les niveaux de protéines CTRA par western blot à des moments du cycle cellulaire distincts. La DO 600 devrait augmenter d&#39;environ deux fois au cours du cycle c...

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Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

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Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

11.8K vues.  Stanford University School of Medicine. Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.