The authors thank members of the Shapiro lab and Erin Schrader for comments on the manuscript. The authors acknowledge financial support from: NIH postdoctoral fellowship F32 GM100732 to JMS and NIH grants R01 GM51426 and R01 GM32506 to LS.

1. Groß Synchrony - Optimal für Western Blot, Microarray / RNA-Seq und Sonstiges Material Intensive Tests <ol><li> Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen einem 5 ml O / N-Kultur des Stammes NA1000 durch Schütteln bei 28 ° C in PYE Medium. </li><li> Beimpfen von 0,5 ml der Zellen aus Schritt 1 in 25 ml M2G (Tabellen 1-2) und schüttelt bei 28 ° C, bis die Kultur eine OD 600 zwischen 0,5 und 0,6 erreicht. </li><li> Impfen Sie die Zellen in 1 l M2G und schütteln bei 28 ° C. </li><li> Sobald OD 600 erreicht 0,5 bis 0,6, bestätigen das Vorhandensein von Zellen mit Hilfe swarmer montiert flüssigen Phase Mikroskopie. Spot 1 ul der Zellen auf einen Objektträger, Deckel mit einem Deckglas und Bild durch Phasenmikroskopie. Bestätigen des Vorhandenseins von swarmer Zellen durch Visualisierung schneller schwimmen Zellen in der Population. </li><li> Spin-Zellen für 15 min bei 7 KXG bei 4 ° C in einem JA-10-Rotor. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 180 ml kaltes M2 (Tabellen 1-2) und sanft resuspend alle Zellen mit einer serologischen Pipette. Entsorgen Sie lose pelletierten Zellen; sie sind predivisional und stolzierte Zellen. </li><li> 60 ml kalte Kolloidales Siliciumdioxid-Lösung (unbedingt die Kolloidales Siliciumdioxid-Suspension auch vor der Zugabe zu den Zellen mischen) und mischen Sie die Zellsuspension gut. </li><li> Gießen Sie die Zellsuspension in acht 30-ml-Röhrchen und Spin für 30 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20 Rotor. HINWEIS: Man sollte zwei verschiedenen Bands zu sehen; die swarmer Band ist das untere Band während stolzierte / predivisional Zellen sind in der Top-Band (Abbildung 1B). </li><li> Die Top-Band vorsichtig absaugen und entfernen Sie die Flüssigkeit auf ca. 1 cm über dem swarmer Band (das untere Band). </li><li> (Kritisch) Mit einer Pasteur-Pipette, entfernen Sie vorsichtig die swarmer Band aufnehmen und in ein sauberes Röhrchen. Abzuwaschen Kolloidales Siliciumdioxid, oben das Rohr mit kaltem M2 und Schleudern für 10 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor. </li><li> Vorsichtig den Überstand verwerfen und Resuspendieren derZellen in 20 ml kaltem M2 und Schleudern für 10 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor. </li><li> Resuspendieren alle Pellets in 30 ml kaltem M2 und messen Sie die OD 600 mit einem Spektralphotometer und leere mit kaltem M2 Medium. Sparen Sie 1 ul für Phase-Bildgebung für swarmer Zellen überprüfen; 90-95% der Zellen sollten Schwärmer sein. </li><li> Anzentrifugieren die Zellen für 5 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor. Zellen in 28 ° C M2G Medium, so dass der A 600 ist ~ 0,3-0,4 und beginnen bei 28 ° C schüttelnd. HINWEIS: Typische Ausbeuten zwischen 30 und 60 ml swarmer Zellkultur von 1L unsynchronisierten Zellen. </li><li> Fangen Sie an, Zeitpunkte (Wildtyp-Kultur wird in etwa 135 bis 140 Minuten in Anspruch nehmen zu teilen) 8,9. Zu jedem Zeitpunkt, messen Sie die OD 600. Prüfen, ob die OD 600 nach der Teilung ist ungefähr 2X die Anfangs-OD 600. </li><li> Für Western-Blot oder Genexpressionsassays entfernen 1 ml Aliquots der culture zu den gewünschten Zeitpunkten, Spin-down bei max Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für 30 Sekunden, schnell Dekantieren des Mediums, und Flash Einfrieren des Zellpellets in flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die Zellen bei -80 ° C bis Downstream-Analyse. </li></ol> 2. Kleines Synchrony - Optimal für die Mikroskopie <ol><li> Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen ein 5 ml O / N-Kultur unter Schütteln bei 28 ° C im M2G. </li><li> Verdünnen Sie in 15 ml M2G (Tabellen 1-2) und wachsen, bis mid-log (OD 600 = 0,5-0,6). </li><li> Spin 6,4 KXG für 10 min bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor und Resuspension in 1 ml kaltem M2 (Tabellen 1-2) und in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin bei 15 KXG für 3 min in ein Mikrozentrifugenröhrchen Zellen zu pelletieren, absaugen Überstand, legen Sie die Tablette auf Eis, und resuspendieren in 900 ul kaltem M2. </li><li> Hinzufügen 900 ul kaltem PVP beschichtet kolloidales Siliciumdioxid und Spin für 20 min bei 15 KXG bei 4 ° C in einem Mikrofonrocentrifuge Rohr. </li><li> (Critical) Verwerfen Sie pipettieren aus der Spitze marschierte / predivisional Zellband und sammeln Sie die unten swarmer Band in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Waschen der swarmer Zellen zwei Mal in 1 ml kaltem M2 während der Zentrifugation bei 15 KXG für 3 min. </li><li> Vor dem letzten Spin, verschieben Sie die Zellen in eine vorgekühlte 1 ml Reagenzglas und messen Sie die OD 600 der Zellen im Vergleich zu einem Rohling aus M2. </li><li> Resuspendieren die endgültige Zellpellet in 28 ° C M2G bei einer OD von 0,3 bis 0,4 und schütteln / Roll-Zellen bei 28 ° C. Anmerkung: Typische Ausbeuten liegen zwischen 2 und 4 ml swarmer Zellkultur. </li><li> Für die Mikroskopie Experimente, zum gewünschten Zeitpunkt Punkten Platz 1 ul der Zellen auf eine M2G Agarose-Pad für die Bildgebung. </li></ol>

<ol>
	<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control.">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry.">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space.">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li><li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+bacterial+mitosis:+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation.">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li><li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells.">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li><li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway.">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li><li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus.">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li><li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Caulobacter+crescentus.">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li><li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division.">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li><li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin.">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li><li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directly+controlled+by+CtrA,+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle.">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li><li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein.">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li><li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response,+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication.">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li><li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus.">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li><li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+baby+cell+column:+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle.">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li><li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle.">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).</li><li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus.">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li><li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus.">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179 (2011).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus:+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment.">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The bacterial cell cycle is a fundamental process in life and is important for the study of growth and as a target for next generation antibiotics. Here, we detailed the rapid synchronization procedures for C. crescentus NA1000, a model organism for the study of the bacterial cell cycle and asymmetric cell division. This method is amendable to western blot, gene expression profiling, and fluorescence microscopy assays to investigate the spatiotemporal regulation of the bacterial cell cycle. 
<p class='jove_...

Die bakterielle Zellzyklus steuert sowohl die Replikation des Genoms und die Teilung der Tochterzellen. Wichtig ist, wie Antibiotika-Resistenz ist eine wachsende Bedrohung der öffentlichen Gesundheit stellt der bakteriellen Zellzyklus eine ungenutzte Ziel für Antibiotika-Entwicklung. In dem Bakterium Caulobacter crescentus, führt jede Zellzyklus in einer asymmetrischen Teilung, wodurch zwei Tochterzellen unterschiedlicher Schicksal (1A) 1,2. Eine Tochterzelle erbt eine Geißel und ist beweglich, während die andere Tochter erbt einen Stiel und sitzend. Eine integrierte genetische Schaltung steuert Zellzyklus und Zellschicksal von Transkriptionsregulation, Phospho-Signalisierung und regulierte Proteolyse 3. Zusätzlich Chromosomenreplikation und gleichzeitige Trennung Ausbeute Tochterzellen, die genau eine Kopie des Chromosoms 4 enthalten. Wichtig ist, dass diese beiden Zelltypen schnell durch collo getrennt werdenidal Silicateilchen Dichtezentrifugation im synchronisierbar NA1000 Stamm 5-7 ermöglicht die Isolierung der swarmer Zellen aus dem Rest der Population mit hohen Ausbeuten (1B). Isoliert swarmer Zellen dann synchron gehen durch asymmetrische Zellteilung. Hier haben wir ausführlich das Protokoll für die Synchronisierung von Caulobacter Belastung NA1000. Wir bieten Protokolle und gemeinsame Tipps zur Fehlerbehebung für Klein- und angelegte Synchronisationen. Das experimentelle Verfahren bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die räumlich-zeitliche Kontrolle der Caulobacter Zellzyklus und Zellschicksal zu verhören.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PVP Coated Colloidal Silica (Percoll)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Colloidal Silica (Ludox AS-40)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">420840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">JA10 Rotor</td>
			<td style="width:71px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">JA20 Rotor</td>
			<td style="width:71px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">334831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferrous Sulfate Chelate Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0720-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:71px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0621-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synchronization of caulobacter crescentus for investigation of the bacterial cell cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronisations ergibt typischerweise zwei Banden von Zellen (1B): der swarmer Band, das eine höhere Dichte hat, und eine gestielte / predivisional Zellenband mit geringerer Dichte. Um sicherzustellen, dass effiziente Synchronisation gemeinsame Kontrollen umfassen die Überwachung der OD 600 und Messung der Konzentrationen von Ctra Protein durch Western-Blot auf verschiedene Zellzykluszeitpunkten. Die OD 600 sollte um etwa 2-fach im Verlauf des Zellzyklus (Figur 2)</stron...

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Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

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Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

11.8K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine. Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.