The authors thank members of the Shapiro lab and Erin Schrader for comments on the manuscript. The authors acknowledge financial support from: NIH postdoctoral fellowship F32 GM100732 to JMS and NIH grants R01 GM51426 and R01 GM32506 to LS.

1. Sincronía a gran escala - óptimo para el Western Blot, Microarray / RNA-Seq, y otros ensayos intensivos de materiales <ol><li> De una acción congelador o una placa, crecer un 5 ml O / N de la cultura NA1000 cepa por agitación a 28 ° C en medio PYE. </li><li> Inocular 0,5 ml de las células de la etapa 1 en 25 ml de M2G (Tablas 1-2) y agitar a 28 ° C hasta que el cultivo alcanza una OD 600 entre 0,5 y 0,6. </li><li> Se inoculan las células en 1 l de M2G y agitar a 28 ° C. </li><li> Una vez DO600 alcanza de 0,5 a 0,6, confirmar la presencia de swarmer células utilizando microscopía fase líquida montada. Punto 1 l de células sobre un portaobjetos de vidrio, cubierta con una hoja de la cubierta, y la imagen por microscopía de fase. Confirmar la presencia de células swarmer mediante la visualización de las células que nadan rápidamente en la población. </li><li> Girar las células durante 15 min a 7 kxg a 4 ° C en un rotor JA-10. </li><li> Descartar el sobrenadante y añadir 180 ml de frío M2 (Tablas 1-2) y cosa suavementeuspend todas las células utilizando una pipeta serológica. Deseche células poco granuladas; que son las células predivisional y acechado. </li><li> Añadir 60 ml de solución de sílice coloidal frío (asegúrese de mezclar la suspensión de sílice coloidal bien antes de añadir a las células) y mezclar bien la suspensión celular. </li><li> Verter la suspensión de células en ocho tubos de 30 ml y centrifugar durante 30 min a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20. NOTA: Hay que ver a dos bandas distintas; la banda swarmer es la banda más baja mientras acechadas células / predivisional están en la banda superior (Figura 1B). </li><li> Aspirar con cuidado la banda superior y retire el líquido a ~ 1 cm por encima de la banda swarmer (la banda inferior). </li><li> (Crítica) Con una pipeta Pasteur, retire con cuidado la banda swarmer y colocar en un tubo limpio. Para lavar la sílice coloidal, parte superior del tubo con frío M2 y centrifugado durante 10 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20. </li><li> Desechar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender ellas células en 20 ml de frío M2 y centrifugado durante 10 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20. </li><li> Resuspender todas las pastillas en 30 ml de frío M2 y medir la OD 600 usando un espectrofotómetro y en blanco utilizando medio M2 frío. Guardar 1 l para la imagen de fase para comprobar swarmer células; 90-95% de las células debería ser enjambres. </li><li> Centrifugar las células durante 5 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20. Resuspender las células en 28 ° C M2G medio de modo que el A 600 es de ~ 0,3-0,4 y comenzar agitación a 28 ° C. NOTA: Los rendimientos típicos son entre 30 y 60 ml de swarmer cultivo celular de 1 litro de células no sincronizadas. </li><li> Comience a tomar los puntos de tiempo (la cultura de tipo salvaje tomará aproximadamente 135-140 minutos para dividir) 8,9. En cada punto de tiempo, medir el OD 600. Compruebe que el OD 600 después de la división es de aproximadamente 2 veces la DO inicial 600. </li><li> Para ensayos de transferencia o de expresión génica occidentales, retirar alícuotas de 1 ml de la culture en los tiempos deseados, de girar a velocidad máxima en una centrífuga de mesa durante 30 segundos, rápidamente decantar o aspirar el medio, y el flash congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido. Guarde las células a -80 ° C hasta el análisis de aguas abajo. </li></ol> 2. Sincronía pequeña escala - Óptimo para Microscopía <ol><li> De una acción congelador o una placa, crecer un cultivo de 5 ml O / N agitación a 28 ° C en M2G. </li><li> Diluir en 15 ml de M2G (Tablas 1-2) y crecer hasta mediados de log (OD 600 = 0,5 a 0,6). </li><li> Giran a 6,4 kxg durante 10 min a 4 ° C en un rotor JA-20, y se vuelve a suspender en 1 ml M2 frías (Tablas 1-2) y transferir a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. </li><li> Giran a 15 kxg durante 3 min en un tubo de microcentrífuga para sedimentar las células, aspirar el sobrenadante, el sedimento se puso en hielo, y resuspender en 900 l de frío M2. </li><li> Añadir 900 l de PVP frío recubierto de sílice coloidal y centrifugado durante 20 minutos a 15 kxg a 4 ° C en un microtubo rocentrifuge. </li><li> (Crítica) Aspirar o una pipeta de la parte superior de banda celular acechado / predivisional y recoger la parte inferior swarmer banda en un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Lavar las células dos veces en swarmer 1 ml de frío, mientras que M2 centrifugación a 15 kxg durante 3 min. </li><li> Antes de que el centrifugado final, mover las células en un tubo de ensayo de vidrio de 1 ml pre-enfriada y medir la OD 600 de las células en comparación con un blanco de M2. </li><li> Resuspender el precipitado celular final a 28 ° C M2G a una DO entre 0,3 a 0,4 y agitar células / rollo a 28 ° C. NOTA: Los rendimientos típicos son entre 2 y 4 ml de cultivo celular swarmer. </li><li> Para los experimentos de microscopía, a la deseada puntos temporales lugar 1 l de células sobre una almohadilla de agarosa M2G para la imagen. </li></ol>

<ol>
	<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control.">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry.">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space.">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li><li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+bacterial+mitosis:+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation.">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li><li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells.">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li><li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway.">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li><li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus.">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li><li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Caulobacter+crescentus.">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li><li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division.">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li><li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin.">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li><li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directly+controlled+by+CtrA,+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle.">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li><li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein.">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li><li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response,+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication.">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li><li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus.">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li><li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+baby+cell+column:+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle.">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li><li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle.">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).</li><li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus.">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li><li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus.">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179 (2011).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus:+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment.">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The bacterial cell cycle is a fundamental process in life and is important for the study of growth and as a target for next generation antibiotics. Here, we detailed the rapid synchronization procedures for C. crescentus NA1000, a model organism for the study of the bacterial cell cycle and asymmetric cell division. This method is amendable to western blot, gene expression profiling, and fluorescence microscopy assays to investigate the spatiotemporal regulation of the bacterial cell cycle. 
<p class='jove_...

El ciclo celular bacteriana controla tanto la replicación del genoma y la división de las células hijas. Es importante destacar que, como la resistencia a los antibióticos es una amenaza creciente para la salud pública, el ciclo celular bacteriana presenta un objetivo sin explotar para el desarrollo de antibióticos. En la bacteria Caulobacter crescentus, cada ciclo celular conduce a una división asimétrica, produciendo dos células hijas de diferentes destinos (Figura 1A) 1,2. Una célula hija hereda un flagelo y es móvil, mientras que la otra hija hereda un tallo y es sésiles. Un circuito genético integrado controla la progresión del ciclo celular y destino celular mediante la regulación transcripcional, fosfo-señalización, y proteólisis regulada 3. Además, la replicación de cromosomas y células hijas rendimiento segregación concurrentes que contienen exactamente una copia del cromosoma 4. Es importante destacar que estos dos tipos de células se pueden separar rápidamente por colloidal partícula de sílice centrifugación de densidad en la cepa NA1000 sincronizable 5-7 permitiendo el aislamiento de las células swarmer del resto de la población con altos rendimientos (Figura 1B). Aislado swarmer células luego proceder de forma sincrónica a través de la división celular asimétrica. Aquí, detallamos el protocolo utilizado para sincronizar Caulobacter cepa NA1000. Proporcionamos protocolos y sugerencias para solucionar problemas comunes para ambos de gran y pequeña escala sincronizaciones. Este procedimiento experimental proporciona una poderosa herramienta para interrogar el control espacio-temporal del ciclo celular Caulobacter y destino celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PVP Coated Colloidal Silica (Percoll)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Colloidal Silica (Ludox AS-40)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">420840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">JA10 Rotor</td>
			<td style="width:71px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">JA20 Rotor</td>
			<td style="width:71px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">334831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferrous Sulfate Chelate Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0720-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:71px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0621-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synchronization of caulobacter crescentus for investigation of the bacterial cell cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Sincronización típicamente produce dos bandas de células (Figura 1B): la banda swarmer, que tiene una densidad más alta, y una banda de células tallo / predivisional de menor densidad. Para asegurar los controles comunes de sincronización eficiente incluyen la supervisión de la OD 600 y la medición de los niveles de proteína CtrA por Western blot en momentos distintos del ciclo celular. La OD 600 debería aumentar en aproximadamente 2 veces durante el curso del ciclo celul...

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Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Sincronización de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Para la Investigación del Ciclo Celular Bacteriana

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

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Research

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Biology

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

11.8K vistas.  Stanford University School of Medicine. Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.