The authors thank members of the Shapiro lab and Erin Schrader for comments on the manuscript. The authors acknowledge financial support from: NIH postdoctoral fellowship F32 GM100732 to JMS and NIH grants R01 GM51426 and R01 GM32506 to LS.

1. larga scala Synchrony - ottimale per Western Blot, Microarray / RNA-Seq, e altro materiale saggi Intensive <ol><li> Da uno stock congelatore o un piatto, crescere a 5 ml O / N cultura del ceppo NA1000 agitando a 28 ° C in PYE medio. </li><li> Inoculare 0,5 ml delle cellule dal punto 1 in 25 ml di M2G (Tabelle 1-2) e agitare a 28 ° C fino alla cultura raggiunge un OD 600 tra 0,5 e 0,6. </li><li> Inoculare le cellule in 1 L di M2G e agitare a 28 ° C. </li><li> Una volta OD 600 raggiunge 0.5 a 0.6, confermare la presenza di swarmer cellule utilizzando liquido montato microscopio fase. Spot 1 ml di cellule su un vetrino, coprire con un vetrino, e l&#39;immagine al microscopio fase. Confermare la presenza di cellule Swarmer visualizzando cellule in rapida nuoto nella popolazione. </li><li> Spin cellule per 15 minuti a 7 kxg a 4 ° C in un rotore JA-10. </li><li> Scartare il surnatante e aggiungere 180 ml di freddo M2 (Tabelle 1-2) e res delicatamenteuspend tutte le cellule utilizzando una pipetta sierologica. Eliminare le celle liberamente pellet; sono cellule predivisional e se ne andò. </li><li> Aggiungere 60 ml di soluzione fredda di silice colloidale (assicuratevi di mescolare la sospensione di silice colloidale bene prima di aggiungere alle cellule) e mescolare bene la sospensione cellulare. </li><li> Versare la sospensione cellulare in otto 30 ml provette e centrifugare per 30 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20. NOTA: Si dovrebbe vedere due bande distinte; la band Swarmer è la banda più bassa, mentre le cellule / predivisional stalking sono nella fascia superiore (Figura 1B). </li><li> Aspirare accuratamente la banda superiore e rimuovere il liquido ~ 1 cm sopra la banda swarmer (la banda inferiore). </li><li> (Critico) Usando una pipetta Pasteur, rimuovere con attenzione la band swarmer e posto in una provetta pulita. Per lavare via la silice colloidale, superiore al tubo via con freddo M2 e girare per 10 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un JA-20 del rotore. </li><li> Eliminare attentamente il surnatante e risospendere ilcellule in 20 ml di freddo M2 e centrifuga per 10 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20. </li><li> Risospendere i pellet in 30 ml di freddo M2 e misurare la OD 600 utilizzando uno spettrofotometro e vuoto utilizzando freddo medio M2. Salva 1 ml per l&#39;imaging di fase per verificare swarmer cellule; 90-95% delle cellule dovrebbe essere sciami. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 min a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20. Risospendere le cellule in 28 ° C M2G media in modo che la A 600 è ~ 0,3-0,4 e iniziare agitazione a 28 ° C. NOTA: i rendimenti tipici sono tra 30 e 60 ml di swarmer coltura cellulare da 1L di cellule non sincronizzate. </li><li> Cominciare a prendere punti di tempo (la cultura di tipo selvatico richiede circa 135-140 minuti per dividere) 8,9. Ad ogni punto di tempo, misurare il diametro esterno 600. Controllare che la OD 600 dopo la divisione è pari a circa 2 volte l&#39;OD iniziale 600. </li><li> Per macchia o di espressione genica test occidentali, rimuovere 1 ml aliquote della culture nei punti di tempo desiderato, centrifugare a velocità massima in una centrifuga da tavolo per 30 sec, rapidamente decantare o aspirare il mezzo, e flash congelare il pellet cellulare in azoto liquido. Conservare le cellule a -80 ° C fino all&#39;analisi valle. </li></ol> 2. piccola scala Synchrony - ottimale per Microscopia <ol><li> Da uno stock congelatore o un piatto, crescere un / cultura 5 ml O N agitazione a 28 ° C in M2G. </li><li> Diluire in 15 ml di M2G (Tabelle 1-2) e crescere fino a metà-log (OD 600 = 0.5-0.6). </li><li> Spin a 6.4 kxg per 10 minuti a 4 ° C in un JA-20 del rotore, e risospendere in 1 ml freddi M2 (Tabelle 1-2) e trasferimento in una provetta 2 ml. </li><li> Spin a 15 kxg per 3 minuti in una provetta a pellet cellule, aspirare il surnatante, mettere il pellet sul ghiaccio, e risospendere in 900 ml di freddo M2. </li><li> Aggiungere 900 ml di PVP freddo rivestiti di silice colloidale e girare per 20 minuti a 15 kxg a 4 ° C in un microfonotubo rocentrifuge. </li><li> (Critico) Aspirare o pipettare dalla cima pedinato banda di cellule / predivisional e raccogliere il fondo swarmer banda in una nuova provetta. </li><li> Lavare le cellule due volte swarmer in 1 ml di freddo M2 mentre centrifugazione a 15 kxg per 3 min. </li><li> Prima della centrifuga finale, spostare le celle in un pre-raffreddata 1 ml provetta di vetro e misurare la OD 600 delle cellule rispetto ad un bianco di M2. </li><li> Risospendere il pellet cellulare finale in 28 ° C M2G ad un OD tra 0,3-0,4 e scuotere cellule / rotolo a 28 ° C. NOTA: i rendimenti tipici sono tra 2 e 4 ml di coltura cellulare swarmer. </li><li> Per gli esperimenti di microscopia, a intervalli di tempo desiderato posto 1 ml di cellule su un pad agarosio M2G per l&#39;imaging. </li></ol>

<ol>
	<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control.">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry.">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space.">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li><li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+bacterial+mitosis:+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation.">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li><li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells.">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li><li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway.">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li><li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus.">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li><li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Caulobacter+crescentus.">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li><li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division.">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li><li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin.">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li><li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directly+controlled+by+CtrA,+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle.">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li><li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein.">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li><li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response,+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication.">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li><li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus.">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li><li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+baby+cell+column:+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle.">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li><li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle.">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).</li><li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus.">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li><li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus.">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179 (2011).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus:+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment.">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The bacterial cell cycle is a fundamental process in life and is important for the study of growth and as a target for next generation antibiotics. Here, we detailed the rapid synchronization procedures for C. crescentus NA1000, a model organism for the study of the bacterial cell cycle and asymmetric cell division. This method is amendable to western blot, gene expression profiling, and fluorescence microscopy assays to investigate the spatiotemporal regulation of the bacterial cell cycle. 
<p class='jove_...

Il ciclo cellulare batterica controlla sia la replicazione del genoma e la divisione di cellule figlie. È importante sottolineare che, come la resistenza agli antibiotici è una crescente minaccia per la salute pubblica, il ciclo cellulare batterica presenta un obiettivo non sfruttata per lo sviluppo di antibiotici. In batterio Caulobacter crescentus, ogni ciclo cellulare porta ad una divisione asimmetrica, ottenendo due cellule figlie di sorti diverse (Figura 1A) 1,2. Una cellula figlia eredita un flagello ed è mobile, mentre l&#39;altra figlia eredita un gambo ed è sessile. Un circuito genetico integrato controlla la progressione del ciclo cellulare e destino cellulare da regolazione trascrizionale, fosfo-segnalazione, e proteolisi regolata 3. Inoltre, la replicazione dei cromosomi e cellule figlie rendimento segregazione simultanee che contengono esattamente una copia del cromosoma 4. È importante sottolineare che questi due tipi di cellule possono essere rapidamente separati da colloIdal particella di silice centrifugazione densità nel ceppo sincronizzabile NA1000 5-7 consente l&#39;isolamento delle cellule swarmer dal resto della popolazione con rese elevate (Figura 1B). Isolato swarmer cellule quindi procedere in modo sincrono attraverso la divisione cellulare asimmetrica. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo usato per la sincronizzazione Caulobacter ceppo NA1000. Forniamo protocolli e risoluzione dei problemi comuni sia larga e piccola scala sincronizzazioni. Questa procedura sperimentale fornisce un potente strumento per interrogare il controllo spazio-temporale del ciclo cellulare Caulobacter e il destino delle cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PVP Coated Colloidal Silica (Percoll)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Colloidal Silica (Ludox AS-40)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">420840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">JA10 Rotor</td>
			<td style="width:71px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">JA20 Rotor</td>
			<td style="width:71px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">334831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferrous Sulfate Chelate Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0720-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:71px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0621-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synchronization of caulobacter crescentus for investigation of the bacterial cell cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Sincronizzazione tipicamente produce due bande di cellule (Figura 1B): la banda swarmer, che ha una densità più elevata, e una banda cellulare pedinato / predivisional di densità inferiore. Per garantire la sincronizzazione efficiente controlli comuni comprendono il monitoraggio della OD 600 e misurando i livelli di proteina Ctra da Western Blot in distinte del ciclo cellulare punti di tempo. La OD 600 dovrebbe aumentare di circa 2 volte nel corso del ciclo cellulare (Fi...

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Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Sincronizzazione di<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Per Indagine del ciclo cellulare batterica

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

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Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

11.8K Views.  Stanford University School of Medicine. Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.