Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en génie du Canada en sciences naturelles et. Microfabrication a été réalisée avec le soutien de l&#39;installation McGill Nanotools Microfab à l&#39;Université McGill et le département d&#39;électronique de l&#39;Université Carleton.

Le sang est prélevé d&#39;individus sains avec l&#39;approbation du comité d&#39;éthique de l&#39;Université d&#39;Ottawa (H11-13-06). 1. Microchannel Fabrication Les microcanaux sont fabriqués selon les méthodes classiques de photolithographie 18. <ol><li> Concevoir la géométrie de microcanaux en utilisant une conception (CAO) assistée par ordinateur et imprimer la configuration sur un transparent photo-masque. Ces masques sont essentiels car ils déterminent le trajet de lumière pendant le processus de fabrication. Dans ce cas, les dimensions de microcanaux sont de 120 um d&#39;épaisseur, 60 um de profondeur et 7 mm de longueur. </li><li> Dans une salle blanche, dépôt à la tournette une résine époxy à base de résine photosensible négative sur une plaquette de silicium à 2000 tours par minute pendant 30 secondes pour obtenir la profondeur désirée de microcanaux (60 um). </li><li> Exposer la tranche et le photo-masque sous une lampe UV à 650 mJ / cm 2 à 70 sec. Assurez-vous d&#39;exposer uniquement les zones transparentes de laphoto-masque à la lumière UV. L&#39;exposition des zones transparentes permet la polymérisation des chaînes aboutissant à un durcissement de la résine photosensible. Immerger la pièce de silicium en un développeur pour enlever l&#39;excès de résine photosensible. </li><li> Une fois que le moule est fabriqué, mélanger un élastomère à base de silicium et un agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 pour créer une solution de poly-diméthyl-siloxane (PDMS). Mettre la solution PDMS dans une chambre à vide pour dégazer. Verser dans le moule et faire chauffer à 60 ° C pendant 90 min pour créer microcanaux. Puis lier les canaux individuels à une lame de verre en utilisant une liaison par plasma d&#39;oxygène pendant 90 secondes. REMARQUE: le processus de dégazage PDMS est effectuée afin d&#39;éliminer les bulles d&#39;air engendrés par le processus de mélange. </li><li> Veiller à ce que les dimensions de microcanaux permettent de tests avec succès. Dans ce protocole, les micro-canaux ont une section rectangulaire de 120 x 60 um. En comparaison, une moyenne de RBC a un diamètre de 8 um et une épaisseur de 2 um. Lerefore, la largeur de microcanaux suffit d&#39;observer l&#39;agrégation appropriée et de déterminer avec précision les profils de vitesse. </li></ol> 2. Préparation de sang <ol><li> Prélever le sang de donneurs volontaires en bonne santé, après l&#39;approbation d&#39;un comité d&#39;éthique. On traite le sang avec de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) présent dans les tubes de collecte (7,2 mg d&#39;EDTA dans 4 ml de sang). NOTE: L&#39;EDTA est utilisé pour éviter la coagulation du sang. </li><li> Centrifuger les échantillons de sang trois fois pendant 10 min à 1400 x g (3000 rpm) en vue de séparer les constituants du sang. À la suite de la centrifugation, observer trois couches distinctes. REMARQUE: Les trois couches sont la couche de RBC (situé au fond du tube), la couche leucocyto-plaquettaire (constitué par les cellules et les plaquettes sanguines blanches situées sur le dessus de la couche RBC) et la couche de plasma (qui se trouve au-dessus de tous les autres constituants). <ol><li> Après la première centrifugation, recueillir le plasma sanguin à l&#39;aide d&#39;une pipette de sang. Eviter tout contactez avec la couche leucocytaire. </li><li> Ramasser et éliminer la couche leucocytaire dans un récipient avec l&#39;eau de Javel diluée à 10%. </li><li> Ajouter 3 ml de PBS pH 7,4 à chacun des tubes de la couche de RBC restant et assurer le bon équilibre de la centrifugeuse. Mélanger délicatement les tubes et centrifuger une fois de plus à 1400 xg (3000 rpm) pendant 10 min. NOTE: Assurez-vous que la solution de PBS ne contient pas de magnésium ou de calcium, car ils pourraient modifier l&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Éliminer le PBS dans les tubes après la deuxième centrifugation et retirer la couche leuco-plaquettaire résiduelle si elle est présente. Répétez les étapes 2.2.3 et 2.2.4 pour la troisième centrifugation pour obtenir des globules rouges propres. </li></ol></li><li> Mélanger la quantité requise (0,05, 0,1 et 0,15 ml) de globules rouges propres avec plasma (0,95, 0,9 et 0,85 ml) dans un tube de 1 ml pour obtenir RBC-suspensions avec le correspondant (5%, 10% et 15% ) hématocrite. Vérifiez hématocrites avec une microcentrifugeuse. </li></ol> 3. Fluides Préparation <ol><li> Ajouter 60 ul de la solution de particules de traceur fluorescent (1% de matières solides, particules d = 0. 86 pm, λ = 542 nm abs et λ = 612 nm émission) dans les tubes 1 ml RBC-suspension. REMARQUE: Les particules traceuses fluorescentes (teints à l&#39;intérieur des particules de polystyrène) sont utilisés pour mesurer la vitesse de l&#39;écoulement à l&#39;intérieur du microcanal. Ces particules fluorescent lorsqu&#39;il est exposé à la longueur d&#39;onde correspondante du faisceau laser (λ = 542 nm). </li><li> Préparer une solution de PBS à pH 7,4 et ajouter 60 ul de la solution de même fluorescent particules de traceur dans 1 ml de la solution PBS. </li></ol> 4. Granulats Taille Dimensions <ol><li> Pour insérer les fluides (RBC-suspensions et PBS) dans le microcanal, utiliser deux seringues en verre de 25 pi et 100 pi. Cette volontécontribuer à réduire la conformité du système. Connecter les microcanaux aux seringues via un tube et des connecteurs ajustés les trous d&#39;entrée. Remplir les seringues en verre à l&#39;aide de la différence de pression existant entre le réservoir de fluide et la seringue. Assurez-vous qu&#39;aucun des bulles sont présentes dans le système. Comme méthode alternative, utiliser un système à pression contrôlée à conduire les deux fluides dans le microcanal. </li><li> Placez le microcanal sur une platine du microscope inversé relié à une caméra à grande vitesse et un système μPIV. Programme de la pompe de la seringue pour les débits souhaités (par exemple, Q = 2 pl / h pour le sang engendrant un débit de Q = 8 pi / h pour PBS). NOTE: Une seule pompe à seringue est utilisée. L&#39;utilisation de deux seringues en verre différents, avec deux diamètres intérieurs différents, il est possible de faire varier le débit à l&#39;entrée de chaque branche de l&#39;Y-microcanal. </li><li> Insérer les deux fluides dans la double Y-microcanaux chacun d&#39;une entrée branche différente et à différents débits comme indiqué dans <strong&gt; Figure 1. Afin de tester différents taux de cisaillement, changer le débit de la pompe. Cela permet de maintenir le même ratio approprié (4 dans ce cas) entre les deux branches 19 (figures 2 et 3). Attendez que le débit pour atteindre l&#39;état d&#39;équilibre avant d&#39;acquérir les mesures: inspecter visuellement les images de la caméra à haute vitesse pour un flux lisse. Remarque: Le ratio est crucial pour obtenir un profil de vitesse linéaire à l&#39;intérieur de la couche de sang. </li><li> Visualisez les globules rouges à l&#39;aide de la caméra haute vitesse. Branchez l&#39;appareil photo à un ordinateur pour contrôler, enregistrer et enregistrer les images de l&#39;écoulement du fluide. Une fois que les deux écoulements de fluides atteignent l&#39;état d&#39;équilibre, commencer l&#39;enregistrement. <ol><li> Acquérir plusieurs images pour de meilleurs résultats de traitement. Déterminez un temps d&#39;exposition de la caméra optimale pour une image claire des agrégats. NOTE: Le temps d&#39;exposition de la caméra pour ce cas est de 0,5 ms. Le choix de l&#39;intervalle de temps entre chaque trame est basée sur la fréquence d&#39;image de la caméra et le débit en til microcanaux. Le temps entre chaque trame traitée dans cette procédure était de 60 msec. Par conséquent, un appareil capable d&#39;enregistrer 18 images par seconde est suffisante. REMARQUE: Évitez décantation de sang dans le tube et la seringue, ce qui pourrait conduire à des mesures erronées. </li></ol></li><li> En utilisant des techniques de traitement d&#39;image (un programme MATLAB dans ce cas) pour améliorer la qualité d&#39;image, de détecter les agrégats dans chacune des images sur la base des intensités de pixels (représentés sur la figure 4) comme suit: <ol><li> Améliorer les images contrastent avec la méthode histogramme de l&#39;égaliseur pour obtenir une meilleure qualité d&#39;image pour chaque trame. </li><li> Convertir les images en niveaux de gris en images binaires. A cet effet, définir une valeur de seuil, compris entre 0 et 1, qui dicte la conversion de chaque pixel. Tout pixel dans l&#39;image ci-dessous de la valeur seuil sera détecté comme un pixel noir, tandis que les pixels avec des valeurs plus grandes que le seuil sera détecté comme pixels blancs. </li><li> Remplissez ledes trous (si elle est présente et nécessaire) correspondant aux écarts dans l&#39;agrégat pour de meilleurs résultats. </li><li> Détecter les cellules en déterminant des pixels blancs voisins dans l&#39;image binaire de sorte que les cellules adjacentes sont associés sous forme d&#39;agrégats. </li><li> Étiqueter les différents agrégats détectés et convertir l&#39;image binaire en une image rouge-vert-bleu (RVB) pour une meilleure visualisation. Combiner les trames originales avec chacune des images traitées correspondant à vérifier l&#39;efficacité de la technique de traitement d&#39;image et de veiller à ce que toutes les cellules sont prises en considération, comme le montre la Figure 5. Effectuer les étapes 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 et 4.5.5 pour toutes les trames capturées. </li><li> Calculer l&#39;aire de chaque agrégat détecté dans la trame sur la base du nombre de pixels détectés. Basé sur le grossissement de l&#39;objectif utilisé, calculer le facteur de conversion, en utilisant un réticule d&#39;étalonnage, et de convertir les résultats de 2 um. La moyenne des tailles d&#39;agrégats détectés dans chaquecadre, puis la moyenne des résultats pour tous les cadres pour obtenir la taille moyenne globale pour chaque enregistrement de RBC-suspensions. </li><li> Calculer l&#39;aire d&#39;un RBC pour déterminer un nombre estimatif représentant de globules rouges dans chaque agrégat détecté. A partir de ces résultats, le calcul de la répartition du pourcentage de globules rouges à l&#39;intérieur de chaque agrégat en fonction de la taille d&#39;agrégat (représentés par une estimation du nombre de cellules dans chaque agrégat), comme représenté sur la Figure 6. NOTE: Pour mesurer les agrégats de RBC, le logiciel ImageJ pourrait être utilisé (au lieu de MATLAB) pour effectuer les mêmes tâches sur chaque trame. </li></ol></li></ol> 5. Fluide de vitesse et la vitesse de cisaillement Mesures Déterminer la vitesse du fluide et donc le taux de cisaillement en utilisant un système μPIV. <ol><li> Une fois que les données sont acquises en utilisant la caméra haute vitesse, passer à la caméra à double pulsé utilisé pour le système μPIV. Utilisez un logiciel d&#39;imagerie pour l&#39;image acquisition de l&#39;écoulement et le traitement d&#39;image pour la détermination du champ de vitesse. </li><li> Prenez toutes les précautions nécessaires, en fonction de la classe du laser, avant de se tourner sur le laser. Puis tourner sur le système, la caméra et le laser. </li><li> Calibrer l&#39;appareil en fonction de l&#39;agrandissement de l&#39;objectif utilisé. A cet effet, utiliser un micro-précision de 10 um sous le microscope et définir la taille de 1 pixel dans l&#39;image. </li><li> Lancer le laser et de visualiser les particules dans les deux fluides. Trouver le plan médian des microcanaux en se concentrant sur ​​les particules les plus rapides dans le débit (à savoir, les particules les plus rapides devraient être les plus brillants). </li><li> Réglez le dt (intervalle de temps entre deux trames consécutives) pour assurer le bon déplacement de la particule. Les particules les plus rapides doivent se déplacer environ 5 à 10 pixels entre les deux images. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement du flux. Réglez le logiciel à acquérir 100 paires d&#39;images, 5 ms d&#39;intervalle. Effectuer les étapes 5.4, 5.5 et 5.6 pour tous les difdiffé- RBC-suspensions et pour les différents taux de cisaillement. NOTE: Plus de détails de la méthode sont donnés dans l&#39;étude de Pitts et Fenech 20. </li><li> Traiter les enregistrements acquis en utilisant la méthode de corrélation croisée avec le logiciel d&#39;imagerie. REMARQUE: Elle consiste à discrétiser la paire d&#39;images en petites fenêtres de taille prédéterminée (par rapport à l&#39;écoulement de fluide et l&#39;intervalle de temps choisi par l&#39;utilisateur) appelé de fenêtres de corrélation et en suivant le déplacement des particules dans chaque fenêtre. <ol><li> Tout d&#39;abord, de déterminer si les images acquises nécessitent de pré-traitement (y compris la soustraction de fond, &quot;base-clipping&quot; 21 ou l&#39;image se chevauchent 22,23) pour un meilleur traitement des données. </li><li> Ensuite, choisissez la taille de la fenêtre de corrélation et la forme, ainsi le pourcentage des images qui se chevauchent. Une étude détaillée a été réalisée par Pitts et al. 24 afin de déterminer les paramètres optimaux et techniques image pré-traitement pour le sangcirculer dans des configurations de canaux différents. Exprimer les résultats en un champ de vitesse moyenne calculée à partir des 100 paires d&#39;images et l&#39;erreur quadratique moyenne (RMS) de la vitesse. </li></ol></li><li> Extraire un profil de vitesse à la sortie du canal, à partir des données traitées comme montré sur la figure 7. Pour un meilleur profil, en moyenne le champ de vitesse dans l&#39;espace. REMARQUE: Les barres qui composent le profil de vitesse correspond à la taille de fenêtre de corrélation choisi par rapport à la largeur du canal. L&#39;erreur RMS de la vitesse est également représenté sur la figure 7, représentant l&#39;erreur dans l&#39;estimation de vitesse expérimentale. </li><li> Éteignez le laser une fois que toutes les mesures et les traitements sont effectués ,. Arrêtez tous les composants du système: logiciels, caméras, stade déplacement, les ordinateurs et laser. </li><li> Pour calculer la vitesse de cisaillement, d&#39;une part détecter et estimer l&#39;épaisseur de sang dans le microcanal sur la base de l&#39;enregistrement de la caméra grande vitesse. A cet effet, la moyenne de toutesles trames spécifique dans l&#39;enregistrement afin d&#39;obtenir une image d&#39;arrière-plan de la vidéo. Délimiter la couche de sang (comme représenté sur la figure 8 pour les RBC-suspensions fluides à 10 ul / h lorsqu&#39;il est en suspension à 5%, 10% et 15% hématocrite). Obtenir la valeur de la vitesse de l&#39;épaisseur de la couche de sang correspondant et calculer la vitesse de cisaillement en divisant la valeur de la vitesse par l&#39;épaisseur de la couche de sang. </li></ol>

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Les auteurs ont rien à révéler.

En utilisant la méthodologie actuelle, il est possible d&#39;analyser qualitativement et quantitativement la RBC regroupe sous différentes conditions d&#39;écoulement et hématocrites. Pour le test avec succès et la détection globale, il est essentiel de déterminer le rapport de vitesse approprié entre les deux fluides à l&#39;entrée du microcanal. Ce rapport est très important pour obtenir une épaisseur de couche de sang optimal où le profil de vitesse est quasi-linéaire 19. <p class="jove_c...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Les globules rouges (hématies) jouent un rôle crucial dans la détermination du comportement rhéologique de sang. Ils sont presque singulièrement responsable des propriétés particulières du sang in vitro et in vivo. Dans des conditions physiologiques, les RBC occupent 40% à 45% du volume sanguin. Dans la microcirculation, les globules rouges ne occupent jusqu&#39;à 20% du volume de sang en raison de diamètre des vaisseaux plus petits et le plasma écrémage effet 1. Ce phénomène de réduction du plasma dans la microcirculation est connu comme l&#39;effet Fahraeus. A des taux de cisaillement faibles, les globules rouges sont en mesure de combler ensemble et former une ou dimensions des structures tridimensionnelles appelés &quot;rouleaux&quot; ou agrégats, contribuant ainsi au comportement non-newtonien du sang. Cependant, le mécanisme d&#39;agrégation RBC est pas complètement compris. Deux théories existent pour modéliser l&#39;agrégation des globules rouges: le pontage de la théorie des cellules due à la réticulation des macromolécules 2 et l&#39;attrac de forcethéorie de l&#39;épuisement tion provoquée par des molécules due au gradient osmotique 3. Typiquement, pour le sang humain, des agrégats se forment à des taux de cisaillement très faibles 4 allant de 1 à 10 s -1. Au-dessus de cette gamme, les globules rouges ont tendance à désagréger et de débit séparément dans le navire. Comprendre les conditions de la formation d&#39;agrégats est d&#39;une grande importance pour le domaine de hémorhéologie en termes de définition comportement rhéologique de sang. Ces agrégats sont souvent vus au niveau de macrocirculation (&gt; 300 um de diamètre) 5. A cette échelle, le sang est considéré comme un fluide newtonien et d&#39;un mélange homogène. Cependant, ces agrégats sont rarement observés dans le niveau capillaire (4-10 um de diamètre) et sont habituellement une indication d&#39;états pathologiques tels que le diabète et l&#39;obésité 6. Autres conditions pathologiques qui pourraient changer l&#39;agrégation RBC inclut conditions inflammatoires ou infectieuses,les maladies cardiovasculaires telles que l&#39;hypertension ou l&#39;athérosclérose, les maladies génétiques et des maladies chroniques 7. Par conséquent, la compréhension du mécanisme d&#39;agrégation RBC et l&#39;analyse de ces entités (en définissant une relation entre la taille de ces agrégats et les conditions d&#39;écoulement) peut conduire à la compréhension du comportement microrhéologiques de sang et par conséquent le relier à des applications cliniques. RBC agrégats peuvent être modifiés par plusieurs facteurs tels que l&#39;hématocrite (volume de globules rouges dans le sang), le taux de cisaillement, le diamètre du récipient, la raideur de la membrane RBC et la composition du milieu de mise en suspension 10.8. Par conséquent, des conditions contrôlées sont nécessaires afin d&#39;analyser efficacement les agrégats de RBC. Plusieurs méthodes sont capables d&#39;analyser la formation d&#39;agrégats en fournissant des mesures d&#39;agrégation statiques (indice d&#39;agrégation) qui offre des informations pertinentes sur le comportement de sang. Ces procédés comprennent, entre autres, la vitesse de sédimentationProcédé selon 11, le procédé de transmission de lumière 12, le procédé de réflexion de lumière 13 et la méthode de viscosité à faible cisaillement 14. Peu d&#39;études ont tenté d&#39;étudier l&#39;agrégation RBC et de déterminer le degré d&#39;agrégation dans des conditions d&#39;écoulement contrôlées 15-17. Cependant, ces études examinent indirectement RBC tailles agrégées par la détermination du rapport de l&#39;espace occupé dans un système de cisaillement mesurée à partir d&#39;images microscopiques du sang fournissant des informations sur le degré d&#39;agrégation, ainsi que la viscosité locale. Nous présentons donc une nouvelle procédure de quantifier directement RBC regroupe la microcirculation, dynamiquement, en vertu des taux de cisaillement constante et contrôlée. RBC-suspensions sont entraînés, dans un double Y-microcanaux (comme cela est illustré sur la figure 1), avec un tampon phosphate salin (PBS) créant ainsi un écoulement de cisaillement dans la couche de sang. Dans ce sang couche A karité constantetaux de r peut être obtenue. Les suspensions de RBC sont testés à différents hématocrite (H) des niveaux (5%, 10% et 15%) et sous différents taux de cisaillement (11/02 sec -1). La vitesse du sang et le taux de cisaillement sont déterminées en utilisant un système de micro Particle Image Velocimetry (μPIV) tandis que le flux est visualisée à l&#39;aide d&#39;une caméra à haute vitesse. Les résultats obtenus sont ensuite traités avec un code MATLAB sur la base des intensités de l&#39;image afin de détecter les globules rouges et de déterminer les dimensions globales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

Le sang, comme un fluide biologique non newtonien, représente l&#39;objet de nombreuses études dans le domaine de hémorhéologie. les constituants du sang comprennent les globules rouges, les globules blancs et de plaquettes qui sont en suspension dans le plasma sanguin. En raison de l&#39;abondance des globules rouges (40% à 45% du volume du sang), leur comportement détermine le comportement rhéologique du sang en particulier dans la microcirculation. A taux de cisaillement très faibles, les globules rouges sont perçus à assembler et entités forment des agrégats appelés, ce qui provoque le comportement non-newtonien du sang. Il est important de comprendre les conditions de la formation d&#39;agrégats de comprendre la rhéologie du sang dans la microcirculation. Le protocole décrit ici en détail la procédure expérimentale pour déterminer quantitativement les agrégats de RBC dans la microcirculation sous taux de cisaillement constant, basée sur le traitement d&#39;image. A cet effet, RBC-suspensions sont testés et analysés en 120 x 60 um poly-diméthyl-siloxane (PDMS) microcanaux. Les suspensions sont RBC-entplu l&#39;aide d&#39;un deuxième fluide, afin d&#39;obtenir un profil de vitesse linéaire à l&#39;intérieur de la couche de sang et de réaliser ainsi une large gamme de taux de cisaillement constant. Le taux de cisaillement est déterminée en utilisant un système de micro Particle Image Velocimetry (μPIV), tandis que les agrégats de RBC sont visualisées en utilisant une caméra à haute vitesse. Les vidéos capturées des agrégats RBC sont analysées en utilisant des techniques de traitement d&#39;image afin de déterminer les dimensions globales sur la base des intensités des images.

Un exemple de l&#39;écoulement à deux fluides dans le double Y-microcanal est représenté sur la Figure 2 pour les globules rouges humains en suspension à 5%, 10% et 15% d&#39;hématocrite et circulant à 10 ul / h. La Figure 3 montre la différence dans les tailles agrégées lorsque l&#39;écoulement dans le canal est réduite de 10 ul / h à 5 ul / h pour un hématocrite de 10%. Cela donne une notion qualitative de la taille des agrégats en variant l&#39;hématocrite et du taux ...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Le protocole décrit les détails d&#39;une procédure expérimentale pour quantifier Red Blood Cell (RBC) agrégats sous un taux de cisaillement contrôlé et constant, basé sur des techniques de traitement d&#39;image. L&#39;objectif de ce protocole est de relier RBC tailles d&#39;agrégats au taux de cisaillement correspondant dans un environnement microfluidique contrôlée.

Environnement microfluidique contrôlée pour Dynamic Investigation of Blood Red Cell Agrégation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K vues.  University of Ottawa.  Le protocole décrit les détails d'une procédure expérimentale pour quantifier Red Blood Cell (RBC) agrégats sous un taux de cisaillement contrôlé et constant, basé sur des techniques de traitement d'image. L'objectif de ce protocole est de relier RBC tailles d'agrégats au taux de cisaillement correspondant dans un environnement microfluidique contrôlée. 

Vidéo: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Recherche

Bio-ingénierie

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopie corrélative pour l&#39;analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d&#39;adhésion cellulaire putatif

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Entièrement automatisé centrifuge microfluidique Dispositif pour Ultrasensitive Protein Détection de sang total

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

L&#39;agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-étape Hauteur variable photolithographie pour dispositifs microfluidiques à valve Multilayer

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

A microfluidique débit Chambre Modèle pour Platelet Transfusion et Hémostase mesures Platelet Déposition et la formation de fibrine en temps réel

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...