Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.

Remarque: Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation Commission institutionnelle animale de l&#39;Université du Texas Health Science Center de San Antonio et étaient conformes aux directives arrivent. 1. L&#39;anesthésie pour corticale Préparation <ol><li> Passer la souris dans une chambre d&#39;induction avec 2-3% d&#39;isofluorane mélangé avec l&#39;oxygène pour induire une anesthésie. Observez la diminution du taux de respiration que la souris est induite. Pincez la patte de la souris pour déterminer si la souris est prête à passer à l&#39;ogive. Remarque: le niveau d&#39;anesthésie est une étape critique dans une préparation in vivo et il faut veiller à ne pas induire un niveau qui va provoquer une ischémie globale. </li><li> Une fois que la souris est suffisamment anesthésié, transférer l&#39;animal à la chirurgie / plate-forme d&#39;imagerie et placer le nez de la souris dans le cône de nez et d&#39;appliquer 1-1,2% isofluorane de maintenir un état anesthésié. Assurez-vous que la souris est allongée sur un co de températureCoussin chauffant ntrolled pour maintenir la température corporelle (37 ° C +/- 0,5 ° C) tout au long des procédures restantes. Placez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. </li><li> Surveiller la physiologie de la souris en utilisant un système d&#39;oxymétrie de pouls à l&#39;aide du pied ou de la queue de clip fourni avec le système. Vérifiez que la fréquence respiratoire est maintenue entre 50-65 respirations / min. Vérifiez que la fréquence cardiaque reste entre 300 à 450 bpm et la saturation en oxygène est maintenue entre 97-98% pour assurer la survie à long terme de l&#39;animal. </li><li> Lorsque la souris est correctement anesthésié, de se raser les cheveux sur le crâne à l&#39;aide des tondeuses électriques, enlever les poils résiduelle et propre avec de la bétadine, suivi par un tampon imbibé d&#39;éthanol. Répétez cette procédure jusqu&#39;à trois fois pour assurer un environnement chirurgical stérile. </li></ol> 2. Procédure chirurgicale <ol><li> Avec le cuir chevelu entièrement nettoyée et rasée, faire une incision de 5 mm dans le cuir chevelu de la souris pour révéler le fissu crânienneres et de localiser bregma. </li><li> Utilisez un applicateur de coton stérile pour éliminer toute fascia restants recouvrant le crâne. </li><li> Collez une bague sur mesure en acier inoxydable (figure 1) avec de la colle de tissu à l&#39;os recouvrant le cortex pariétal en utilisant les coordonnées stéréotaxiques de Bregma: -1 à -3 mm et latérale: 2-4 mm. Remarque: La colle définit généralement dans les 2 minutes après le placement de l&#39;anneau sur l&#39;os. </li><li> Fixez la bague à un titulaire stéréotaxique (figure 2) pour stabiliser la souris et empêcher tout mouvement pendant l&#39;imagerie. </li><li> En vertu d&#39;une dissection chirurgicale de qualité microscope, percer lentement une section de 1-2 mm dans le crâne à l&#39;aide d&#39;un outil de dremel-comme la vitesse contrôlée (Meisinger 3,9 mm foret) en veillant à maintenir le niveau de la zone comme il est percé. Atteindre cet objectif en utilisant un motif en zig-zag. Pour éviter l&#39;accumulation de chaleur, régler la vitesse de forage à bas et prendre des pauses fréquentes. </li><li> Lorsque le crâne crânienne devient brillant en apparence, continuer l&#39;amincissementdu crâne en utilisant une lame de scalpel en utilisant le même motif en zig-zag afin de maintenir le niveau de surface amincie pour faciliter le retrait en douceur de couches minces de crâne crânienne. Avec la pointe de la lame de bistouri faire de petits coups de linéaires avec une légère pression pour enlever des couches minces d&#39;os à la fois. Continuer jusqu&#39;à ce que le système vasculaire est clairement visible à travers le microscope de dissection. </li><li> Si l&#39;expérimentateur perce à travers ou briser le crâne pendant le processus d&#39;amincissement, euthanasier l&#39;animal en raison de dommages susceptibles de le cortex sous-jacent. Remarque: le crâne de la souris est d&#39;environ 300 um d&#39;épaisseur et est constituée de deux couches minces d&#39;os compact (une externe et une couche interne) et une couche d&#39;os spongieux pris en sandwich entre les deux couches de l&#39;os compact. La couche externe de l&#39;os compact et plus de l&#39;os spongieux sont éliminés dans la zone de perçage 5 mm pour résultat une couche d&#39;environ 50 um d&#39;os compact restant (voir la figure 2B). Visualization de la vascularisation fera en sorte que le crâne amincie intact finale est d&#39;environ 50 um d&#39;épaisseur. Le crâne est donc toujours présent lorsque amincie à cette épaisseur. </li></ol> 3. Microscope Set-up <ol><li> Utiliser un système de microscope inversé (classique, à foyer commun ou système à deux photons) qui a un onduleur objectif. Remarque: Il est également possible d&#39;utiliser un microscope droit standard. Le facteur limitant sera l&#39;espace entre la scène et les objectifs. Les modifications apportées à la scène peuvent être nécessaires pour accomplir cette configuration. </li><li> Fixez la plate-forme chirurgicale / imagerie à un stade sur mesure qui se trouve côté de la base du microscope. Remarque: La plate-forme est faite en utilisant un vérin de laboratoire pour permettre un mouvement vertical de la plate-forme chirurgicale / imagerie sous l&#39;objectif. Le vérin de laboratoire est monté sur une plaque fixée à quatre pôles cylindriques. (Voir Figure 2). </li><li> Positionner l&#39;onduleur objectif contenant un 20Xobjectif sur la fenêtre crânienne. Utilisez une source de lumière externe pour trouver la fenêtre crânienne en regardant à travers les oculaires du microscope et de positionner l&#39;objectif dans le domaine de l&#39;imagerie. Remarque: La zone de formation d&#39;image sera noté par la présence de la vasculature. </li><li> Pour les objectifs à base d&#39;eau, en utilisant le fluide spinal cérébral artificiel (aCSF) (NaCl 130 mM; KCl 30 mM; 12 mM de KH 2 PO 4; 200 mM de NaHCO 3; 30 mM de HEPES et 100 mM de glucose) en tant que milieu en raison du risque fuite dans la cavité crânienne pendant l&#39;imagerie (Figure 3). </li></ol> 4. Rose Bengale Dye préparation, l&#39;administration et l&#39;induction de l&#39;AVC <ol><li> Préparer une solution / ml frais de 20 mg de Rose Bengale artificielle liquide céphalo-rachidien (aCSF); filtrer et stériliser avant l&#39;administration. Ne pas réutiliser ou stocker le Bengale Rose une fois qu&#39;il a été mitigée. Faire une solution fraîche pour chaque expérience. </li><li> Donner une injection dans la veine de la queue 0,1 ml de Rose Bengale tandis que sla mise en conserve fenêtre crânienne avec un laser 561 nm pour assurer l&#39;injection adéquate de la solution. Remarque: Rose Bengale sera visualisée dans les 5 secondes après l&#39;injection dans le système vasculaire du cerveau. Le navire entier doit être rempli avec Rose Bengale. </li><li> Après une injection suffisante de colorant rose Bengale choisir un récipient approprié pour une thrombose sur la base de récipient de diamètre (40 à 80 um) pour assurer la reproductibilité d&#39;un volume de la lésion donnée. Différencier les artères et les veines en regardant la direction du flux sanguin: artères vont se déplacer de plus grand diamètre à des navires de plus petit diamètre, les veines se déplacent de plus petits navires de plus grand diamètre. Ceci est facilement accompli par la visualisation une fois Rose Bengale est injecté. </li><li> Changez le réglage de microscope comme suit: <ol><li> Augmenter le temps de séjour. Remarque: Ce variera en fonction du système de microscope est utilisée. </li><li> Augmenter la puissance du laser à 100%. </li><li> Recueillir des images de séquence de temps à 1 image / s en utilisant lavitesse de balayage maximale. </li></ol></li><li> Balayer la souris jusqu&#39;à un caillot stable est formé à l&#39;intérieur de la cuve. Note: Ceci est généralement réalisé dans les 5 min de balayage continu (Voir Figure 4). </li><li> Suite à l&#39;induction de la formation de caillot avec Rose Bengale, retirer la souris à partir de la zone d&#39;imagerie revenir à la loupe binoculaire. Retirez délicatement l&#39;anneau en acier inoxydable du crâne crânienne. Examinez la fenêtre crânienne pour des saignements. Si le saignement se produit, mettre fin à l&#39;expérience. </li><li> Utilisez 6.0 monofilament suture pour fermer l&#39;incision sur le crâne. Passer onguent antibiotique sur la ligne de suture pour prévenir l&#39;infection. Injecter Buprenex (0,05 mg / kg) sous-cutanée toutes les 12 heures pendant trois jours pour la gestion de la douleur. </li><li> Retourner la souris pour une chambre de récupération après le retrait de l&#39;anesthésie jusqu&#39;à pleinement éveillé et se déplacer librement. </li><li> Retour de la souris dans une cage propre pour complément d&#39;enquête à une date ultérieure. </li></ol> 5. Imagerie longitudinale les jours suivants <ol><li> Employer les méthodes suivantes pour effectuer l&#39;imagerie longitudinale les jours suivants post-photothrombosis. <ol><li> Anesthésier la souris comme décrit dans la section 1 des méthodes. </li><li> Après une anesthésie adéquate ré-ouvrir le cuir chevelu en supprimant toutes les sutures résiduelles de rouvrir la peau recouvrant le domaine de l&#39;imagerie percé précédemment. </li><li> Utilisez un applicateur de coton stérile pour éliminer toute fascia restants recouvrant le crâne. </li><li> Collez une bague sur mesure en acier inoxydable (figure 1) avec de la colle de tissu à l&#39;os recouvrant le domaine de l&#39;imagerie précédente. </li><li> Fixez la bague à un titulaire stéréotaxique (figure 2) pour stabiliser la souris et empêcher tout mouvement pendant l&#39;imagerie. </li><li> Localisez le système vasculaire sous-jacente du crâne préalablement amincie. Utilisation injection dans la veine de la queue de FITC-dextrane pour vérifier la présence du caillot précédemment induit. </li><li> Utilisez 6.0 monofilament suture pour fermer la danscision sur le crâne. Passer onguent antibiotique sur la ligne de suture pour prévenir l&#39;infection. Injecter Buprenex (0,05 mg / kg) sous-cutanée toutes les 12 heures pendant trois jours pour la gestion de la douleur. </li><li> Retourner la souris pour une chambre de récupération après le retrait de l&#39;anesthésie jusqu&#39;à pleinement éveillé et se déplacer librement. </li></ol></li></ol> 6. Vérification de l&#39;induction de l&#39;AVC (post-mortem) <ol><li> À la conclusion d&#39;une étude, vérifier que le volume de la course en utilisant 2,3,5-triphényltétrazolium chlorure (TTC) coloration comme indiqué sur la Figure 5. La méthode complète peut être trouvée dans 12. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

La capacité à traduire expérimentale course physiopathologie de l&#39;animal à l&#39;application humaine a été en proie à l&#39;échec. Cependant, l&#39;utilisation de modèles animaux, tels que le modèle de photothrombosis, permet d&#39;améliorer la compréhension de la physiopathologie de la course et l&#39;exploration de nouvelles approches thérapeutiques pour fournir une neuroprotection après un AVC. Petits coups et microinfarctions produites par le modèle photothrombotique corticales sont cliniquement p...

La technique décrite permet la visualisation de la réponse cellulaire in vivo, immédiatement après l&#39;induction de Rose Bengale photothrombosis dans une souris intactes. Rose Bengale (4,5,6,7-tétrachloro-2 &#39;, 4&#39;, 5 &#39;, 7&#39;-tétraiodofluorescéine) est un colorant photosensible utilisée pour induire un AVC ischémique dans des modèles animaux (souris et le rat). Suite à une injection en bolus de RB par la veine de la queue et l&#39;illumination ultérieure par un crâne amincie avec une lumière laser de 564 nm, un thrombus est induit provoque un accident vasculaire cérébral physiologique 1. La méthode a été initialement décrit par Rosenblum et El-Sabban, en 1977, et a ensuite été adapté par Watson dans les milieu des années 1980 1,2. En bref, le rose Bengale est irradié avec de la lumière verte d&#39;excitation (laser 561 nm dans notre cas), ce qui génère la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène, qui active ensuite le facteur tissulaire, un initiateur de la cascade de coagulation. L&#39;induction de la cascade de coagulation produit une ischémie lesion qui est pathologiquement pertinentes pour AVC clinique 3. AVC a une physiopathologie complexe en raison de l&#39;interaction de nombreux types de cellules différents, y compris les neurones, les cellules gliales, l&#39;endothélium et le système immunitaire. Le choix de la meilleure technique pour étudier un processus cellulaire particulier nécessite plusieurs considérations. Techniques expérimentales retrouvent globalement dans une des trois catégories: in vitro, in vivo et in silico chacun ayant des avantages et des inconvénients Des études in vitro ont l&#39;inconvénient principal de l&#39;élimination des cellules de leur milieu naturel et peuvent donc ne pas reproduire les effets observés dans une intacte,. animal vivant. Dans les techniques in vivo Pour renforcer la réplication expérimentale d&#39;états pathologiques avec une importance accrue de translation. Dans silico se réfère généralement à la modélisation informatique d&#39;une maladie ou d&#39;un processus cellulaire, et alors que de plus en plus utilisé pour étudier les interactions médicamenteuses potentielles pour examenple, toute information recueillie doit encore être testée dans des cellules ou des tissus vivants. Le modèle idéal de la course dans le cadre d&#39;un laboratoire doit démontrer les caractéristiques pathologiques similaires à ceux observés dans la population humaine. Bien qu&#39;il existe des caractéristiques physiologiques communes de l&#39;AVC dans la population humaine, il ya aussi beaucoup de différences selon le type de dommage subi. AVC dans la population humaine se produit que de petites ou grandes occlusions des vaisseaux, des lésions hémorragiques, et l&#39;artère à artère ou cardio-embolies qui se traduisent par des volumes d&#39;infarctus variées ainsi que des différences dans les mécanismes liés à chaque pathologie. L&#39;avantage de l&#39;utilisation de modèles de course des animaux est la génération des infarctus reproductibles qui imitent les caractéristiques d&#39;un AVC humaine. Les modèles les plus courants de course d&#39;origine animale comprennent occlusion de l&#39;artère en utilisant: occlusion de l&#39;artère cérébrale moyenne (méthodes de filaments ou emboliques endovasculaires) qui distale MCAO modèles et le modèle de photothrombosis. Les avantages d&#39;uninconvénients de chaque modèle d ont été examinés ailleurs (voir 4 et 5). Les modèles globaux ischémiques (MCAO), tout en étant relativement facile à réaliser sont moins pertinents pour la course humaine que sont les modèles de course focaux. En outre, ces procédés sont très variables dans l&#39;induction de lésions d&#39;infarctus cérébral reproductibles. Le modèle de photothrombosis est hautement reproductible aussi longtemps que l&#39;expérimentateur contrôle leurs expériences bien, offrant un net avantage sur les modèles MCAO. Toutefois, en raison de la microvascularisation insulte le modèle a été décrit pour afficher une pénombre ischémique minimale, la zone où les cellules sont pensés pour être récupérable 6,7. En outre, l&#39;oedème vasogénique et la formation de l&#39;oedème cytotoxique peut également être induites après irradiation de la zone d&#39;imagerie. Malgré ces limites de la technique a fourni un nouvel aperçu de nombreux processus physiologiques suivants course 8, 9, 10, 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>330000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>088-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF&#160;</td>
			<td>126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>500-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors 14 cm</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>12-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont High Tech #5 style, straight</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>TWZ-301.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJack 132X80</td>
			<td>Optosigma Co</td>
			<td>123-6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platform for Labjack 8X 8</td>
			<td>Optosigma Co</td>
			<td>145-1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear bar holder from stereotaxic setup</td>
			<td>Stoelting/Cyborg</td>
			<td>51654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine</td>
			<td>DRE, Inc.</td>
			<td>15001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tech IV Isoflurane vaporizer</td>
			<td>DRE, Inc.</td>
			<td>34001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F Air Canister</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>80120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bain circuit breathing tube</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>86111B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent adapter for bain tube</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 regulator for oxygen tanks</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>CE001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent induction chamber</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>15004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle</td>
			<td>Suture Express</td>
			<td>1639G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective inverter Optical Adapter</td>
			<td>LSM technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foredom drill Dual voltage 110/120</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>134.53</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Le but de cette méthode est d&#39;induire un AVC ischémique dans des modèles animaux (souris et rats) après une injection en bolus de RB par la veine de la queue et l&#39;illumination subséquente d&#39;un crâne amincie avec une lumière laser de 561 nm. Les images de la figure 4 montrent l&#39;évolution de la formation de caillots à l&#39;intérieur d&#39;une seule cuve après irradiation de la zone à 0, 1, 1,5 et 2 min. Avant la formation de caillots tout le navire est blanche due à écouleme...

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Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengale Photothrombosis par imagerie optique confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle de l&#39;unité des maladies du navire

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

rose-bengal-photothrombosis-confocal-optical-imaging-vivo-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

14.8K vues.  The University of Texas Health Science Center San Antonio. Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection. 