Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.

Nota: Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Texas Health Science Center di San Antonio e sono stati coerenti con le linee guida arrivano. 1. anestetizzante per corticale Preparazione <ol><li> Posizionare il mouse in una camera di induzione con 2-3% isofluorano mescolato con l&#39;ossigeno per indurre anestesia. Osservare il calo tasso di respirazione come il mouse è indotta. Stringere la zampa del mouse per determinare se il mouse è pronto per passare al cono. Nota: il livello di anestesia è un passo fondamentale in qualsiasi preparazione in vivo e si deve prestare attenzione a non indurre un livello tale da provocare ischemia globale. </li><li> Una volta che il mouse sia sufficientemente anestetizzato, trasferire l&#39;animale alla chirurgia piattaforma / imaging e mettere il naso del mouse nella cono e applicare 1-1,2% isofluorane a mantenere uno stato anestetizzato. Assicurarsi che il mouse è sdraiata su una temperatura di coriscaldamento pad ntrolled per mantenere la temperatura corporea (37 ° C +/- 0.5 ° C) durante le procedure rimanenti. Posizionare veterinario pomata sopra gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Monitorare la fisiologia del mouse utilizzando un sistema pulsossimetria utilizzando la clip coda o piede fornito con il sistema. Controllare che la frequenza respiratoria è mantenuta tra 50-65 atti / min. Verificare che la frequenza cardiaca rimane tra 300 e 450 bpm e la saturazione di ossigeno viene mantenuta tra 97-98% per garantire la sopravvivenza a lungo termine dell&#39;animale. </li><li> Quando il mouse è adeguatamente anestetizzato, radersi i capelli sul cranio con cesoie elettriche, rimuovere i capelli residui e pulita con betadine, seguito da un tampone di etanolo. Ripetere questa procedura fino a tre volte per garantire un ambiente sterile chirurgico. </li></ol> 2. Procedura chirurgica <ol><li> Con il cuoio capelluto completamente pulito e rasato, fare una incisione di 5 mm del cuoio capelluto del mouse per rivelare il fissu cranicores e per individuare bregma. </li><li> Usare un applicatore di cotone sterile per rimuovere eventuali residui fascia sovrastante il cranio. </li><li> Colla un anello misura in acciaio inox (Figura 1) con tessuto adesivo all&#39;osso sovrastante corteccia parietale utilizzando le coordinate stereotassica di Bregma: -1 a -3 mm e laterale: 2-4 mm. Nota: La colla definisce tipicamente entro 2 minuti dopo il posizionamento dell&#39;anello sull&#39;osso. </li><li> Fissare l&#39;anello al titolare stereotassico (Figura 2) per stabilizzare il mouse e per evitare movimenti durante l&#39;imaging. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione chirurgica grado, lentamente praticare un tratto di 1-2 mm nel cranio con un Dremel simile velocità controllata (Meisinger 3,9 millimetri punta) facendo attenzione a mantenere il livello di zona, è forato. Raggiungere questo obiettivo con un percorso a zig-zag. Per evitare l&#39;accumulo di calore, impostare la velocità di punta al minimo e fate pause frequenti. </li><li> Quando il teschio cranica diventa shinny in apparenza, continua il diradamentodel cranio con una lama di bisturi utilizzando lo stesso andamento a zig-zag per mantenere il livello della superficie assottigliata per facilitare la rimozione regolare di strati sottili del cranio cranica. Utilizzando la punta della lama di bisturi fare piccoli tratti lineari con una leggera pressione per rimuovere gli strati sottili di osso per volta. Continuare questo fino a quando il sistema vascolare è chiaramente visibile attraverso il microscopio da dissezione. </li><li> Se lo sperimentatore perfora attraverso o rompere il cranio durante il processo di assottigliamento, l&#39;eutanasia degli animali a causa di probabili danni alla corteccia sottostante. Nota: Il cranio mouse è di circa 300 micron di spessore ed è composto da due strati sottili di osso compatto (uno esterno e uno strato interno) e uno strato di osso spugnoso a sandwich tra i due strati di osso compatto. Lo strato esterno dell&#39;osso compatto e più dell&#39;osso spugnoso vengono rimossi nella zona di foratura 5 millimetri conseguente approssimativa strato 50 micron dell&#39;osso compatto rimanente (vedere la Figura 2B). Visualizzione del sistema vascolare farà in modo che la finale intatto cranio diluito è di circa 50 micron di spessore. Il cranio è quindi ancora presente quando assottigliato a questo spessore. </li></ol> 3. Microscopio Set-up <ol><li> Utilizzare un sistema di microscopio invertito (convenzionale, confocale o sistemi a due fotoni) che ha un inverter obiettivo. Nota: È anche possibile utilizzare un microscopio verticale standard. Il fattore limitante sarà lo spazio tra la fase e gli obiettivi. Le modifiche al palco può essere necessario per realizzare questa configurazione. </li><li> Fissare la piattaforma chirurgica / imaging per una fase su misura che si trova oltre la base del microscopio. Nota: La piattaforma è realizzata con un martinetto di laboratorio per consentire il movimento verticale della piattaforma chirurgica / immagini oggetto dell&#39;obiettivo. La presa di laboratorio è montato su una targhetta fissata a quattro pali cilindrici. (Vedi figura 2). </li><li> Posizionare l&#39;inverter obiettivo contenente un 20Xobiettivo nel finestra del cranio. Utilizzare una fonte di luce esterna per trovare la finestra del cranio, cercando attraverso gli oculari del microscopio e posizionare l&#39;obiettivo nell&#39;area imaging. Nota: L&#39;area di esposizione verrà indicata dalla presenza del sistema vascolare. </li><li> Per obiettivi a base d&#39;acqua, usare fluido cerebrale spinale artificiale (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl, 12 mM KH 2 PO 4; 200 mM NaHCO 3; HEPES 30 mM e 100 mM di glucosio) come mezzo a causa della potenziale perdite nella cavità cranica durante l&#39;imaging (Figura 3). </li></ol> 4. Rosa Bengala Dye Preparazione, gestione e induzione di corsa <ol><li> Preparare una soluzione / ml fresco 20 mg di Rosa Bengala in artificiale cerebrali liquido spinale (aCSF); filtrare e sterilizzare prima della somministrazione. Non riutilizzare o conservare la Rose del Bengala, una volta che è stato mescolato. Fare una soluzione fresca per ogni esperimento. </li><li> Dare un iniezione vena 0,1 ml coda della Rosa Bengala mentre sinscatolare finestra cranica con un laser 561 nm a garantire un&#39;adeguata iniezione della soluzione. Nota: Rosa Bengala verrà visualizzato entro 5 secondi dopo l&#39;iniezione nella vascolatura del cervello. L&#39;intero vaso deve essere riempito con Rosa Bengala. </li><li> Dopo l&#39;iniezione adeguato di Rosa Bengala colorante scegliere una nave appositamente per la trombosi base di diametro del vaso (40-80 micron) per garantire la riproducibilità di un determinato volume della lesione. Distinguere tra arterie e vene guardando la direzione del flusso sanguigno: arterie si muoveranno da diametro maggiore di vasi di diametro minore, vene spostano da piccolo a vasi di diametro maggiore. Questo è facilmente realizzabile da visualizzazione una volta Rosa Bengala viene iniettato. </li><li> Modificare l&#39;impostazione del microscopio come segue: <ol><li> Aumentare il tempo di sosta. Nota: Questo può variare a seconda del sistema di microscopio essendo utilizzato. </li><li> Aumentare la potenza del laser al 100%. </li><li> Raccogliere le immagini di sequenza temporale a 1 frame / sec con ilvelocità di scansione massima. </li></ol></li><li> Acquisire il mouse fino un coagulo stabile si forma all&#39;interno del vaso. Nota: Questo si ottiene in genere entro 5 minuti di scansione continua (vedi figura 4). </li><li> Dopo l&#39;induzione di formazione di coaguli con Rose del Bengala, togliere il mouse dalla area di esposizione di nuovo al microscopio da dissezione. Rimuovere con attenzione l&#39;anello in acciaio inox dal cranio cranico. Esaminare la finestra del cranio per qualsiasi sanguinamento. In caso di emorragia, interrompere l&#39;esperimento. </li><li> Utilizzare 6.0 monofilamento di sutura per chiudere l&#39;incisione sul cranio. Inserire pomata antibiotica lungo la linea di sutura per prevenire l&#39;infezione. Iniettare Buprenex (0,05 mg / kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per tre giorni per la gestione del dolore. </li><li> Ritorna il mouse in una camera di recupero dopo la rimozione dal anestetico fino completamente sveglio e liberamente in movimento. </li><li> Ritorna il mouse in una gabbia pulita per ulteriori indagini in un secondo momento. </li></ol> 5. Imaging longitudinale nei giorni successivi <ol><li> Impiegare i seguenti metodi per eseguire l&#39;imaging longitudinale nei giorni successivi dopo photothrombosis. <ol><li> Anestetizzare il mouse come descritto al punto 1 dei metodi. </li><li> Dopo un&#39;adeguata anestesia riaprire il cuoio capelluto, eliminando eventuali suture residui di riaprire la pelle sovrastante il campo dell&#39;imaging precedentemente realizzato. </li><li> Usare un applicatore di cotone sterile per rimuovere eventuali residui fascia sovrastante il cranio. </li><li> Colla un anello misura in acciaio inox (Figura 1) con tessuto adesivo all&#39;osso sovrastante campo dell&#39;imaging precedente. </li><li> Fissare l&#39;anello al titolare stereotassico (Figura 2) per stabilizzare il mouse e per evitare movimenti durante l&#39;imaging. </li><li> Individuare il sistema vascolare alla base del cranio, in precedenza assottigliata. Utilizzare iniezione vena caudale di FITC-destrano per verificare la presenza del coagulo precedentemente determinati. </li><li> Utilizzare 6.0 monofilamento di sutura per chiudere la acisione sul cranio. Inserire pomata antibiotica lungo la linea di sutura per prevenire l&#39;infezione. Iniettare Buprenex (0,05 mg / kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per tre giorni per la gestione del dolore. </li><li> Ritorna il mouse in una camera di recupero dopo la rimozione dal anestetico fino completamente sveglio e liberamente in movimento. </li></ol></li></ol> 6. Verifica della fase di aspirazione (post-mortem) <ol><li> A conclusione di uno studio, verificare stroke volume usando 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione come mostrato in Figura 5. Il metodo completo può essere trovato in 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).</li><li>Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+in+the+cerebral+microcirculation:+effect+of+aspirin+and+other+agents.">Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents.</a> Circulation Research. 40, 320-328 (1977).</li><li>Owens, A. P., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+tissue+factor+that+contribute+to+thrombosis+after+rupture+of+an+atherosclerotic+plaque.">Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque.</a> Thrombosis Research. 129, S30-S33 (2012).</li><li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+focal+stroke:+size,+mechanism,+and+purpose.">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of stroke models in rats. , (2009).</li><li>Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+middle+cerebral+artery+occlusion+by+an+intraluminal+thread+compromises+collateral+blood+flow.">Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow.</a> Brain Research. 791, 223-228 (1998).</li><li>Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+brain+ischemia+in+the+rat:+methods+for+reproducible+neocortical+infarction+using+tandem+occlusion+of+the+distal+middle+cerebral+and+ipsilateral+common+carotid+arteries.">Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+stimulation+reduces+cytotoxic+edema+and+brain+infarcts+in+mouse+induced+by+photothrombosis+by+energizing+glial+mitochondria.">Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria.</a> PloS One. 5, e14401 (2010).</li><li>Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2. Y. 1. R. -. i. n. i. t. i. a. t. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3R-dependent+stimulation+of+astrocyte+mitochondrial+metabolism+reduces+and+partially+reverses+ischemic+neuronal+damage+in+mouse.">IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).</li><li>Witte, O. W., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+and+remote+effects+of+focal+cortical+infarctions:+secondary+damage+and+reactive+plasticity.">Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity.</a> Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).</li><li>Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+long-term+potentiation+in+the+surround+of+experimentally+induced+focal+cortical+infarction.">Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction.</a> Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).</li><li>Kramer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TTC+staining+of+damaged+brain+areas+after+MCA+occlusion+in+the+rat+does+not+constrict+quantitative+gene+and+protein+analyses.">TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).</li><li>Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+basis+for+the+robust+distribution+of+blood+to+rodent+neocortex.">Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).</li><li>Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+collateral+flow+after+occlusion+of+a+single+cortical+penetrating+arteriole.">Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).</li><li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365 (2007).</li><li>Blum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+after+silent+stroke:+Hippocampus+and+infarcts+both+matter.">Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter.</a> Neurology. 78, 38-46 (2012).</li><li>Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+infarcts+in+the+middle+cerebral+artery+territory+Etiology+and+outcome+patterns.">Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns.</a> Neurology. 50, 341-350 (1998).</li><li>Wardlaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+causes+lacunar+stroke.">What causes lacunar stroke.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery &amp; Psychiatry. 76, 617-619 (2005).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+under+anticoagulant+therapy].+Rinsho+shinkeigaku.">Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku.</a> Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).</li><li>Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Volume+of+the+Focal+Cerebral+Ischemic+Lesion+through+Photothrombosis.">Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis.</a> American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).</li><li>Head, B. P., Patel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+and+brain+protection.">Anesthetics and brain protection.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).</li><li>Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+and+cerebroprotection:+experimental+aspects.">Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects.</a> International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).</li><li>Koerner, I. P., Brambrink, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+protection+by+anesthetic+agents.">Brain protection by anesthetic agents.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).</li><li>Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propofol+anesthesia+compared+to+awake+reduces+infarct+size+in+rats.">Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats.</a> Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).</li><li>Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic+choice+of+halothane+versus+propofol:+impact+on+experimental+perioperative+stroke.">Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke.</a> Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).</li><li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6, 511-512 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La capacità di tradurre sperimentale corsa fisiopatologia da animale ad applicazione umana è stata colpita con il fallimento. Tuttavia, l&#39;utilizzo di modelli animali, come il modello photothrombosis, permette una migliore comprensione di ictus fisiopatologia e l&#39;esplorazione di nuovi approcci terapeutici per fornire neuroprotezione a seguito di un ictus. Piccoli colpi corticali e microinfarctions prodotte dal modello photothrombotic sono clinicamente rilevanti per subcliniche o &quot;silenzioso&quot; colpo <su...

La tecnica descritta consente la visualizzazione delle risposte cellulari in vivo subito dopo l&#39;induzione di Rosa Bengala photothrombosis in un mouse intatto. Rosa Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2 &#39;, 4&#39;, 5 &#39;, 7&#39;-tetraiodofluorescein) è un colorante fotosensibile usato per indurre ictus ischemico in modelli animali (topo e ratto). A seguito di una iniezione in bolo di RB attraverso la vena della coda e la successiva illuminazione attraverso un cranio diluito con una luce laser 564 nm, un trombo è indotta causando un ictus fisiologica 1. Il metodo è stato originariamente descritto da Rosenblum e El-Sabban nel 1977, ed è stato successivamente adattato da Watson a metà 1980 1,2. In breve, Rosa Bengala viene irradiata con luce verde di eccitazione (laser 561 nm nel nostro caso), che genera la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno, che attiva successivamente fattore tissutale, un iniziatore della cascata coagulativa. L&#39;induzione della cascata coagulativa produce un ischemico lesione che è patologicamente rilevanti per ictus clinica 3. Corsa ha una fisiopatologia complessa a causa della interazione di molti tipi di cellule diverse, tra cui neuroni, glia, endotelio e il sistema immunitario. Scegliere la tecnica migliore per studiare un particolare processo cellulare richiede più considerazioni. Tecniche sperimentali rientrano ampiamente in una delle tre categorie: in vitro, in vivo e in silico con ciascuno che ha vantaggi e svantaggi Gli studi in vitro hanno lo svantaggio principale di rimuovere le cellule dal loro ambiente naturale e quindi non possono riprodurre effetti osservati in un intatto,. animale vivente. Nelle tecniche vivo fornire per la replica sperimentale maggiore di patologie con maggiore rilevanza traslazionale. In silico si riferisce generalmente alla modellazione al computer di una malattia o di processo cellulare, e mentre sempre più utilizzato per studiare potenziali interazioni farmacologiche per esamepio, tutte le informazioni raccolte devono ancora essere testato in cellule o tessuti viventi. Il modello ideale di ictus in ambiente di laboratorio deve dimostrare le caratteristiche patologiche simili a quelli osservati nella popolazione umana. Mentre ci sono caratteristiche fisiologiche comuni di ictus nella popolazione umana, ci sono anche molte differenze a seconda del tipo di lesione sperimentato. Corsa nella popolazione umana si verifica come piccoli o grandi occlusioni dei vasi, lesioni emorragiche, e l&#39;arteria a un&#39;arteria o cardio-embolie che si traducono in vari volumi infarto così come le differenze nei meccanismi relativi a ciascuna patologia. Il vantaggio di utilizzare modelli animali di ictus è la generazione di infarti riproducibili che imitano le caratteristiche di ictus umana. I modelli corsa più comuni animali includono occlusione utilizzando: mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale (metodi incandescenza embolici o endovascolare), che i modelli distale MCAO e il modello photothrombosis. I vantaggi di und svantaggi di ciascun modello sono stati riesaminati altrove (vedi 4 e 5). Modelli globali ischemici (MCAO), mentre relativamente facile da eseguire sono meno rilevanti per ictus umano che sono modelli ictus focali. Inoltre, questi metodi sono molto variabili nell&#39;indurre riproducibili lesioni infarto cerebrale. Il modello photothrombosis è altamente riproducibile finché sperimentatore controlla loro esperimenti bene, fornendo un chiaro vantaggio rispetto ai modelli MCAO. Tuttavia, a causa microcircolo insultare il modello è stato descritto per visualizzare una penombra ischemica minima, l&#39;area in cui le cellule si pensa siano recuperabili 6,7. Inoltre, vasogenico e formazione edema citotossico possono essere indotte dopo irradiazione dell&#39;area imaging. Nonostante queste limitazioni la tecnica ha fornito una nuova visione molti processi fisiologici seguenti ictus 8, 9, 10, 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>330000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>088-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF&#160;</td>
			<td>126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>500-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors 14 cm</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>12-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont High Tech #5 style, straight</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>TWZ-301.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJack 132X80</td>
			<td>Optosigma Co</td>
			<td>123-6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platform for Labjack 8X 8</td>
			<td>Optosigma Co</td>
			<td>145-1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear bar holder from stereotaxic setup</td>
			<td>Stoelting/Cyborg</td>
			<td>51654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine</td>
			<td>DRE, Inc.</td>
			<td>15001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tech IV Isoflurane vaporizer</td>
			<td>DRE, Inc.</td>
			<td>34001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F Air Canister</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>80120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bain circuit breathing tube</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>86111B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent adapter for bain tube</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 regulator for oxygen tanks</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>CE001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent induction chamber</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>15004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle</td>
			<td>Suture Express</td>
			<td>1639G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective inverter Optical Adapter</td>
			<td>LSM technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foredom drill Dual voltage 110/120</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>134.53</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Lo scopo di questo metodo è di indurre un ictus ischemico in modelli animali (topo e ratto) a seguito di un bolo di RB attraverso la vena della coda e successiva illuminazione di un cranio diluito con una luce laser 561 nm. Le immagini in Figura 4 mostrano la progressione della formazione del coagulo in un unico recipiente dopo irradiazione dell&#39;area a 0, 1, 1,5 e 2 min. Prima di formazione di coaguli l&#39;intero vaso è bianco a causa di flusso libero Rosa Bengala. Dopo l&#39;induzione di irradia...

Watch this Scientific Journal Video about Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke at JoVE.com

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

rose-bengal-photothrombosis-confocal-optical-imaging-vivo-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

14.8K Views.  The University of Texas Health Science Center San Antonio. Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection. 