Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.

Hinweis: Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt und wurden im Einklang mit den Leitlinien ANKOMMEN. 1. Anästhesie für Cortical Vorbereitung <ol><li> Platzieren Sie die Maus in eine Induktionskammer mit 2-3% Isofluran mit Sauerstoff gemischt, um Anästhesie zu induzieren. Beachten Sie die Atemfrequenz ab, wenn die Maus induziert. Klemmen Sie die Pfote der Maus, um festzustellen, ob die Maus ist bereit, an den Nasenkegel bewegen. Hinweis: Anesthesia Ebene ist ein entscheidender Schritt in einer in vivo-Erstellung und darauf zu achten, nicht auf ein Niveau, das globale Ischämie verursachen induzieren. </li><li> Sobald die Maus ausreichend betäubt, übertragen Sie die Tier der Operation / Imaging-Plattform und legen Sie mit der Maus die Nase in der Nasenkegel und gelten 1-1,2% Isofluran, einen betäubten Zustand zu halten. Sicherzustellen, dass die Maus auf eine Temperatur co liegendenntrolled Heizkissen um die Körpertemperatur (37 ° C +/- 0,5 ° C) während der restlichen Verfahren, aufrechtzuerhalten. Zeigen vet Salbe über die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Überwachen Sie die Physiologie der Maus mit einer Pulsoximetrie-System mit dem Schwanz oder Fuß-Clip mit dem System zur Verfügung gestellt. Überprüfen Sie, ob die Atemfrequenz zwischen 50-65 Atemzüge / min gehalten. Überprüfen Sie, ob die Herzfrequenz bleibt zwischen 300 bis 450 bpm und Sauerstoffsättigung wird zwischen 97-98% gehalten, um langfristige Überleben des Tieres zu gewährleisten. </li><li> Wenn die Maus ausreichend betäubt, rasieren die Haare über der Schädeldecke mit elektrischen Haarschneider, entfernen Sie restlichen Haare und sauber und mit Betadin, gefolgt von einer Ethanol-Tupfer. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu dreimal, um eine sterile OP-Umgebung zu gewährleisten. </li></ol> 2. Chirurgisches Verfahren <ol><li> Mit der Kopfhaut vollständig gereinigt und rasiert, einen 5 mm Einschnitt in die Kopfhaut der Maus, um die Schädel fissu zeigenres und Bregma finden. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Baumwoll-Applikator, um alle verbleibenden Faszie über dem Schädel zu entfernen. </li><li> Kleben Sie eine maßgeschneiderte Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen der über dem parietalen Kortex mit den stereotaktischen Koordinaten Bregma: -1 bis -3 mm und Quer: 2-4 mm. Hinweis: Der Leim bindet normalerweise innerhalb von 2 min nach dem Aufsetzen des Ringes auf den Knochen. </li><li> Das Anbringen der Ring zu einer stereotaktischen Halter (2), um die Maus zu stabilisieren und um eine Bewegung während der Bilderzeugung zu verhindern. </li><li> Unter einem chirurgischer Qualität Binokular, langsam bohren Sie ein 1-2 mm Abschnitt in der Schädeldecke mit einem drehzahlgeregelten dremel artiges Werkzeug (Meisinger 3,9 mm Bohrer) und achten Sie auf den Bereich zu halten, wie es gebohrt wird. Erreichen dies unter Verwendung eines Zick-Zack-Muster. Um Hitze zu vermeiden aufzubauen, setzen Sie den Bohrer Geschwindigkeit niedrig und machen Sie regelmäßig Pausen. </li><li> Wenn der Hirnschädel wird shinny in Erscheinung, auch weiterhin die Ausdünnungdes Schädels mit einer Skalpellklinge unter Verwendung der gleichen Zickzack-Muster, um den ausgedünnten Oberflächen Niveau zu halten, um glatte Entfernung von dünnen Schichten der Hirnschädel zu erleichtern. Mit der Spitze der Skalpellklinge machen kleine lineare Hübe mit leichtem Druck, um dünne Schichten von Knochen zu einer Zeit, zu entfernen. Fahren Sie diese bis zum Gefäßsystem ist eindeutig durch das Binokular sichtbar. </li><li> Wenn der Experimentator durchsticht oder brechen durch den Schädel in der Ausdünnungsverfahren, das Tier einschläfern aufgrund wahrscheinlich Beschädigung des darunterliegenden Kortex. Die Maus-Schädel ist etwa 300 um dick und besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen (eine äußere und eine innere Schicht) und eine Schicht aus Spongiosa zwischen den zwei Schichten aus kompaktem Knochen besteht, sandwichartig angeordnet. Die äußere Schicht kompakten Knochens und die meisten der Spongiosa innerhalb des 5 mm Bohrbereich was zu einer ungefähr 50 &amp; mgr; m-Schicht kompakten Knochens verbleibenden entfernt (siehe 2B). Visualization des Gefäßsystems wird sichergestellt, dass die endgültige verdünnte intakten Schädel ist etwa 50 &amp; mgr; m in der Dicke. Der Schädel ist also noch vorhanden ist, wenn diese Dicke ausgedünnt. </li></ol> 3. Mikroskop Set-up <ol><li> Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop-System (konventionelle konfokale oder Zwei-Photonen-Systeme), die eine Objektivwechselrichter. Anmerkung: Es ist auch möglich, einen Standard aufrechten Mikroskop zu verwenden. Der begrenzende Faktor wird der Raum zwischen der Stufe und den Zielen. Modifikationen an der Bühne kann notwendig sein, um diese Einstellung durchzuführen. </li><li> Sichern Sie die chirurgische / Imaging-Plattform, um eine maßgeschneiderte Bühne, die abgesehen von der Basis des Mikroskops befindet. Anmerkung: Die Plattform ist mit einer Laborbuchse eine Vertikalbewegung des chirurgischen / Imaging Plattform unter dem Ziel ermöglichen gemacht. Die Laborhebebühne ist mit einer Platte, um vier zylindrische Stangen befestigt montiert. (Siehe Abbildung 2). </li><li> Positionieren Sie den Ziel-Wechselrichter, die eine 20-fachZiel im Laufe des Schädelfenster. Verwenden Sie eine externe Lichtquelle, um die Schädelfenster, indem Sie durch die Okulare des Mikroskops zu finden und positionieren Sie das Ziel in der Imaging-Bereich. Hinweis: Der Abbildungsbereich wird durch die Anwesenheit des Gefäßsystems bezeichnet werden. </li><li> Für wasserbasierende Ziele künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH 2 PO 4, 200 mM NaHCO 3, 30 mM HEPES und 100 mM Glucose) als das Medium durch Potential Leckage in die Schädelhöhle während der Abbildung (Abbildung 3). </li></ol> 4. Rose Bengal Dye Vorbereitung, Verwaltung und Induktion von Stroke <ol><li> Eine frische 20 mg / ml Lösung von Rose Bengal in künstliche Rückenmarksflüssigkeit (aCSF); zu filtern und zu sterilisieren vor der Verabreichung. Nicht wiederverwenden oder lagern Sie das Rose Bengal, sobald sie gemischt hat. Machen Sie eine frische Lösung für jedes Experiment. </li><li> Geben Sie eine 0,1 ml Schwanzveneninjektion von Rose Bengal sKonserven die Schädelfenster mit einem 561-nm-Laser, um eine ausreichende Injektion der Lösung zu gewährleisten. Anmerkung: Bengalrosa wird innerhalb von 5 Sekunden nach Injektion in das Gefäßsystem des Gehirns sichtbar gemacht werden. Der gesamte Behälter sollten mit Rose Bengal gefüllt werden. </li><li> Nach ausreichender Injektion von Rose Bengal-Farbstoff wählen einen geeigneten Behälter für Thrombose basierend auf Gefäßdurchmesser (40-80 um), um die Reproduzierbarkeit einer bestimmten Läsion Volumen zu gewährleisten. Differenzieren zwischen Arterien und Venen, indem man die Richtung des Blutflusses: Arterien von größerem Durchmesser zu kleinerem Durchmesser Schiffe bewegen, bewegen Adern auf einen größeren Durchmesser Gefäße. Dies wird einfach durch Visualisierung bewerkstelligt einmal Rose Bengal eingespritzt wird. </li><li> Ändern Sie den Mikroskop-Einstellung wie folgt: <ol><li> Erhöhen Sie die Verweildauer. Anmerkung: Diese wird in Abhängigkeit von der Mikroskopsystems ausgenutzt variieren. </li><li> Erhöhung der Laserleistung auf 100%. </li><li> Sammeln zeitliche Abfolge Bilder auf 1 Bild / s unter Verwendung dermaximale Scangeschwindigkeit. </li></ol></li><li> Scannen der Maus, bis eine stabile Gerinnsel innerhalb des Behälters gebildet wird. Hinweis: Diese Regel wird innerhalb von 5 min der kontinuierliche Abtastung erreicht (siehe Abbildung 4). </li><li> Im Anschluss an die Induktion der Gerinnselbildung unter Verwendung von Bengalrosa, entfernen Sie die Maus von der Bildfläche zurück in die Binokular. Die Edelstahlring vorsichtig aus der Hirnschädel zu entfernen. Untersuchen Sie die Schädelfenster für jede Blutung. Wenn die Blutung auftritt, beenden das Experiment. </li><li> Verwenden Sie 6,0 Monofilamentnahtmaterial, um den Einschnitt über den Schädel zu schließen. Zeigen antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Buprenex (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 Stunden für drei Tage für die Schmerztherapie. </li><li> Gibt die Maus auf eine Wiedergewinnungskammer nach der Entfernung aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen und frei bewegen. </li><li> Gibt die Maus auf eine saubere Käfig für weitere Untersuchungen zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol> 5. Längs Imaging an den folgenden Tagen <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Methoden, um eine Längs Bildgebung bei zukünftigen Tage nach photothrombosis durchzuführen. <ol><li> Betäuben die Maus, wie in Abschnitt 1 der Methoden beschrieben. </li><li> Auf ausreichende Betäubung wieder zu öffnen, die Kopfhaut durch Entfernen alle restlichen Nähte, um die Haut über dem zuvor gebohrten Abbildungsfeld erneut zu öffnen. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Baumwoll-Applikator, um alle verbleibenden Faszie über dem Schädel zu entfernen. </li><li> Kleben Sie eine maßgeschneiderte Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen, die über der früheren Bildfeld. </li><li> Das Anbringen der Ring zu einer stereotaktischen Halter (2), um die Maus zu stabilisieren und um eine Bewegung während der Bilderzeugung zu verhindern. </li><li> Suchen Sie das Gefäßsystem des zuvor ausgedünnten Schädel zugrunde. Verwenden Schwanzveneninjektion von FITC-Dextran, das Vorhandensein der vorher induzierten Gerinnsel verifizieren. </li><li> Verwenden Sie 6,0 Monofilamentnahtmaterial die in zu schließenscheidung über den Schädel. Zeigen antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Buprenex (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 Stunden für drei Tage für die Schmerztherapie. </li><li> Gibt die Maus auf eine Wiedergewinnungskammer nach der Entfernung aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen und frei bewegen. </li></ol></li></ol> 6. Prüfung von Stroke Induction (Post-mortem) <ol><li> Am Ende der Studie, überprüfen Schlagvolumen mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung wie in Abbildung 5 dargestellt. Die vollständige Methode kann in 12 gefunden werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Fähigkeit, experimentellem Schlaganfall Pathophysiologie vom Tier zum Menschen Anwendung übersetzen mit Ausfall geplagt. Jedoch ist die Verwendung von Tiermodellen, wie dem photothrombosis Modell ermöglicht ein besseres Verständnis der Pathophysiologie und der Hub der Erforschung neuer Therapieansätze für die Neuroprotektion bereitzustellen nach einem Schlaganfall. Kleine Schlaganfällen und kortikaler Mikroinfarkten durch die photothrombotic Modell produziert werden, sind klinisch relevant subklinischer oder ...

Die beschriebene Technik ermöglicht die Visualisierung der in vivo zellulären Reaktionen unmittelbar nach der Induktion von Rose Bengal photothrombosis in einer intakten Maus. Rose Bengal (4,5,6,7-Tetrachlor-2 &#39;, 4&#39;, 5 &#39;, 7&#39;-tetraiodofluorescein) ist eine lichtempfindliche Farbstoff verwendet werden, um einen ischämischen Schlaganfall bei Tiermodellen (Maus und Ratte) induzieren. Nach einer Bolus-Injektion von RB durch die Schwanzvene und anschließender Bestrahlung durch einen ausgedünnten Schädel mit einem 564 nm-Laserlicht wird ein Thrombus induzierte verursacht eine physiologische Takt 1. Das Verfahren wurde ursprünglich von Rosenblum und El-Sabban 1977 beschrieben ist, und wurde später von Watson in der Mitte der 1980er Jahre 1,2 angepasst. Kurz gesagt wird Rose Bengal mit grünen Anregungslicht (561 nm-Laser in unserem Fall), welche die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die anschließend aktiviert Gewebefaktor, einen Initiator der Gerinnungskaskade generiert bestrahlt. Die Induktion der Koagulationskaskade erzeugt eine ischämische lesIonen, die pathologisch relevanten klinischen Schlaganfall 3 ist. Hub hat eine komplexe Pathophysiologie aufgrund des Zusammenspiels von vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Endothel und das Immunsystem. Die Auswahl der besten Technik zu studieren, ein bestimmter zellulärer Prozess erfordert mehrere Überlegungen. Experimentelle Techniken fallen grob in eine von drei Kategorien: in vitro, in vivo und in silico mit mit jeweils Vor- und Nachteile In-vitro-Studien haben den Hauptnachteil Entfernung von Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung und daher nicht Effekte in einer intakten gesehen reproduzieren. lebenden Tier. In-vivo-Techniken für eine verbesserte experimentelle Replikation von Krankheitszuständen mit erhöhter Translations Bedeutung. In silico bezieht sich allgemein auf Computermodellierung von einer Erkrankung oder eines zellulären Prozess, und während zunehmend genutzt, um potenzielle Wechselwirkungen für die Prüfung lernenweise alle Informationen zusammengetragen sind immer noch in lebenden Zellen oder Gewebe getestet werden. Das ideale Modell für Schlaganfall in der Laborumgebung sollte ähnlich pathologischen Merkmale mit den in der menschlichen Bevölkerung gesehen zeigen. Zwar gibt es gemeinsame physiologische Eigenschaften von Schlaganfall in der menschlichen Bevölkerung, gibt es auch viele Unterschiede in Abhängigkeit von der Art der Verletzung erfahren. Stroke in der menschlichen Bevölkerung tritt als kleine oder große Gefäßverschlüssen, hämorrhagische Läsionen und Arterie zu Arterie oder Herz-Kreislauf-Embolien, die in vielfältigen Infarktvolumen als auch Unterschiede in Mechanismen, um jede Pathologie führen. Der Vorteil der Verwendung von Tiermodellen Schlaganfall ist die Erzeugung von reproduzierbaren Infarkten, die Eigenschaften des menschlichen Schlaganfall zu imitieren. Die häufigsten Tiertaktmodelle umfassen Arterienverschluss mit: A. cerebri media Okklusion (Embolie oder endovaskuläre Filament-Verfahren), welche Modelle distalen MCAO und die photothrombosis Modell. Die Vorteile einerd Nachteile der einzelnen Modelle wurden an anderer Stelle (siehe 4 und 5). Globale ischämischen Modellen (MCAO), während relativ einfach durchzuführen sind weniger relevant für die menschliche Schlaganfall sind als Brenntaktmodelle. Darüber hinaus sind diese Verfahren sehr variabel zu induzieren reproduzierbare Hirninfarkt Läsionen. Die photothrombosis Modell ist sehr gut reproduzierbar, solange der Experimentator steuert ihre Experimente gut und bietet einen klaren Vorteil gegenüber MCAO-Modelle. Aufgrund Mikrovaskulatur Beleidigung das Modell ist beschrieben worden, um eine minimale ischämischen Penumbra, das Gebiet, in dem Zellen dachte salvageable 6,7 zu sein anzuzeigen. Zusätzlich kann ein vasogenes Ödem und zytotoxische Ödembildung auch nach einer Bestrahlung der Bildfläche induziert werden. Trotz dieser Einschränkungen ist die Technik neue Einblicke in vielen physiologischen Prozessen nach Schlaganfall 8, 9, 10, 11 vorgesehen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>330000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>088-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF&#160;</td>
			<td>126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>500-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors 14 cm</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>12-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont High Tech #5 style, straight</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>TWZ-301.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJack 132X80</td>
			<td>Optosigma Co</td>
			<td>123-6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platform for Labjack 8X 8</td>
			<td>Optosigma Co</td>
			<td>145-1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear bar holder from stereotaxic setup</td>
			<td>Stoelting/Cyborg</td>
			<td>51654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine</td>
			<td>DRE, Inc.</td>
			<td>15001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tech IV Isoflurane vaporizer</td>
			<td>DRE, Inc.</td>
			<td>34001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F Air Canister</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>80120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bain circuit breathing tube</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>86111B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent adapter for bain tube</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 regulator for oxygen tanks</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>CE001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent induction chamber</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>15004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle</td>
			<td>Suture Express</td>
			<td>1639G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective inverter Optical Adapter</td>
			<td>LSM technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foredom drill Dual voltage 110/120</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>134.53</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Das Ziel dieses Verfahrens war es, ein Schlaganfall in Tiermodellen (Maus und Ratte) nach einer Bolus-Injektion von RB durch die Schwanzvene und anschließende Beleuchtung einer dünnt Schädel mit einem 561 nm Laserlicht zu induzieren. Die Bilder in Figur 4 zeigen den Verlauf der Gerinnselbildung in einem einzigen Gefäß nach Bestrahlung des Bereichs auf 0, 1, 1,5 und 2 min. Vor der Gerinnselbildung der gesamte Behälter ist weiß aufgrund fließt Rose Bengal zu befreien. Nach der Induktion der Bestra...

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Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

14.8K Aufrufe.  The University of Texas Health Science Center San Antonio. Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection. 