Les auteurs remercient la Fondation Bill et Melinda Gates pour son appui au développement de la technologie et de la formation.

Remarque: Ce protocole comprend les volumes et les concentrations pour plaque à 96 puits, les bandes 8 à tubes, et des systèmes à base capillaires (volume réactionnel de 10 ul); cependant, HRM peut également être effectuée dans des systèmes à base de plaque 384 puits avec un volume réactionnel de 5 ul par mise à l&#39;échelle correspondante, tous les volumes. La gamme de détection pour la plupart des systèmes est de 10 pg à ADN matrice 10 ng. 1. Préparer des modèles <ol><li> Plasmodium falciparum obtenir des échantillons directement à partir de sang obtenu à partir de patients participant aux études de sites sur le terrain et stockées sous forme de sang total, des globules rouges granulés, ou sur du papier filtre. Note: Les échantillons peuvent également être adaptés à la culture croître in vitro; certaines souches de laboratoire standard pour l&#39;analyse peuvent être commandés à partir du paludisme Réactif de recherche et de référence Resource Center (MR4, les échantillons peuvent être utilisés directement à partir de cultures de cellules ou de globules rouges en granulés ou extraites de sang total, globules rouges, ou papier filtre. </li><li> ADN extrait à partir depapier filtre ou des souches de culture adapté Remarque: HRM est sensible à la concentration de sel; concentration différences dues à des méthodes d&#39;extraction de variables peuvent affecter de manière significative les températures de fusion. Alors que les tampons finales spécifiques ne sont pas un facteur important pour le succès, utiliser une élution ou la remise en suspension tampon standard commun (par exemple, l&#39;eau, 1x Te [«faible Te» ou «tampon de suspension de l&#39;ADN&quot;: 10 mM Tris-Cl, EDTA 0,10] ou 1x TE [10 mM de Tris-Cl, 1 mM d&#39;EDTA]) pour tous les échantillons à éviter des courbes de fusion anormales ou incohérentes. <ol><li> Préparer des dilutions de modèle de 10 pg -10 ng par ml dans la norme Te, TE, ou de l&#39;eau pour chaque réaction de 10 ul. </li></ol></li><li> Amplification directe de globules rouges granulés <ol><li> Déterminer la parasitémie de globules rouges en utilisant la microscopie des frottis mince Remarque: Les méthodes pour déterminer la parasitémie de globules rouges infectés sont disponibles auprès des Centers for Disease Control and Prevention (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Diluer parasitémie supérieure à 0,5% 1: 400 dans la PCR de qualité de l&#39;eau, TE, ou Te. Utilisez 3 pi pour chaque réaction 5- 10 pi. </li></ol></li><li> Contrôles Remarque: HRM peut être utilisé pour un balayage pour détecter des gènes variants de séquence 12 dans une population; Toutefois, le génotypage précise exige des normes séquence-vérifié pour contenir le SNP interrogé. Constructions plasmide ou le paludisme isolats avec des génotypes connus peuvent être utilisés. Pour la plupart des applications, 3D7 (MR4 ARM-151) est utilisé comme un contrôle de type sauvage. En raison de la variabilité inter-séries, toujours inclure des contrôles positifs et négatifs. <ol><li> Les contrôles positifs: Préparer 10 pg - 10 ng par 1 pi des dilutions de plasmide ou de normes avec des génotypes SNP-séquence vérifiée. </li><li> Contrôle négatif: l&#39;eau de qualité PCR utilisation comme un contrôle sans matrice (NTC) pour les réactions d&#39;amplification. </li></ol></li></ol>&quot;&gt; Amplification PCR ve_title 2. <ol><li> Préparer mélange réactionnel <ol><li> (Facultatif) Mineral couche d&#39;huile. Remarque: Certains systèmes de GRH sont les plates-formes de fusion autonomes et ne pas avoir un couvercle chauffé pour éviter la condensation et l&#39;évaporation produit pendant l&#39;amplification. <ol><li> Ajouter 20 ul huile minérale légère à chaque plaque bien avant de charger le mélange réactionnel. </li></ol></li><li> Préparer 10x les stocks de travail de tous les essais <ol><li> Reportez-vous au tableau 1 pour 10x concentrations d&#39;achat d&#39;actions de travail recommandées ainsi que des concentrations finales de génotypage de GRH base-sonde bloqué. </li></ol></li><li> Préparer des mélanges réactionnels <ol><li> Pour chaque puits dans une plaque ou un tube, ajoutez 1 ul 10x stock de travail avant et arrière amorces et des sondes, 4.0 - 2.5x ou 2.0x GRH Master Mix 5.0 pi, 1 modèle de pi, et de l&#39;eau de qualité PCR pour un volume total de réaction de 10 ul . </li></ol></li><li> Plaques ou des tubes de couverture <ol><li> Utilisez optique plaque seals pour l&#39;amplification basée sur plaque, casquettes optiques pour les systèmes basés sur la bande-tubes et bouchons en plastique pour les systèmes à base de capillaires. Soyez sûr couverture est complète et les plaques et les bouchons sont complètement étanche et sécurisé pour empêcher l&#39;évaporation pendant l&#39;amplification. </li></ol></li><li> Des échantillons de spin <ol><li> Plaques Spin 3 min à 1800 xg pour éliminer les bulles d&#39;air et de séparer les phases huileuse et aqueuse, si l&#39;huile minérale est utilisée. </li></ol></li></ol></li><li> Protocole d&#39;amplification <ol><li> Placer des plaques ou des tubes réactionnels dans thermocycleur. Protocoles sonde bloqué ou MAAB amplification standards Run (tableaux 2 et 3, respectivement). Notez la différence de température de recuit entre ces méthodes. </li></ol></li></ol> 3. Analyse de la GRH <ol><li> Faire fondre <ol><li> Après amplification par PCR, procéder à l&#39;analyse de fusion. Pour les systèmes autonomes de fusion qui ne ont pas intégré dans l&#39;amplification (par exemple, des systèmes. BioFire Défense LightScanner), redéplacer la plaque amplifié à partir de cycleur thermique et le lieu de l&#39;instrument de gestion des ressources humaines. Depuis l&#39;interface du logiciel système, faire fondre la plaque de 40 à 80 ° C pour produire les deux sondes et amplicons pics de fusion. Remarque: Pour enregistrer fusion et analyse temps, la fenêtre de fusion peut être raccourcie pour couvrir des plages de température pour seulement sonder ou régions amplicon de fusion. Après fusion, les plaques et les tubes peuvent être re-fondre si nécessaire et stockés à -20 ° C ou 4 ° C. Des tubes de verre de magasin seulement à 4 ° C pour empêcher les tubes de craquage. </li></ol></li><li> Analyse Melt <ol><li> Retirer les échantillons négatifs <ol><li> Dans le logiciel d&#39;analyse, de supprimer d&#39;autres échantillons d&#39;analyse qui ne sont pas amplifier ou qui ont des pics de fusion en escalier. Remarque: après avoir sélectionné le mode d&#39;analyse d&#39;un fichier individuel de l&#39;exécution, l&#39;instrument groupe automatiquement les échantillons positifs et négatifs. Avant de génotypage chaque sous-ensemble, l&#39;utilisateur peut modifier manuellement les appels. <ol><li> De la fusion soitcourbe ou pic de fusion de vue, cliquez-droit sur les courbes d&#39;être retiré pour les sélectionner. Après avoir sélectionné les échantillons mal classés, aller à la &quot;Nouvel appel&quot;, sélectionnez le regroupement approprié, puis cliquez sur &quot;Appliquer les modifications.&quot; </li></ol></li></ol></li><li> Normaliser <ol><li> De la dérivée négative de fluorescence normalisée par rapport à la température (-dF / dT) («Courbes de différence») vue, déplacer les barres de normalisation pour entourer la sonde fondre région. Remarque: La sonde fondre région est inférieure à la température des deux zones de fusion. Les barres de normalisation doivent être à la base des pics de fusion. </li></ol></li><li> Calculer les groupes <ol><li> Après la normalisation, sélectionnez «groupes Calculer» pour assigner automatiquement des échantillons à des groupes. Si nécessaire, des échantillons-Assign re manuellement à des groupes spécifiques. Remarque: Certains logiciels d&#39;analyse a des seuils élevés de sensibilité qui ne peuvent pas être modifiés; dans ces cas, la software pourrait assigner des échantillons à différents groupes qui appartiennent visuellement à l&#39;autre. </li></ol></li><li> Attribuer génotypes <ol><li> Attribuer génotypes pour chaque groupe basé sur les normes (contrôles positifs). <ol><li> Après que l&#39;utilisateur confirme que les groupes calculés se sont correctes (sinon, que les modifications appropriées ont été apportées sous l&#39;onglet Regroupement en sélectionnant des échantillons mal classés et en sélectionnant le groupe de droite de la boîte de dépôt à côté de &quot;Nouvel appel&quot;), sélectionnez &quot;Modifier les noms de groupes &quot;sous l&#39;onglet&quot; Regroupement &quot;. </li><li> Entrez les génotypes des normes dans le cadre de couleur correspondant (par exemple, si 3d7 standard a un connu un génotype et est dans le groupe rouge, le groupe rouge a génotype A). Appuyez sur &quot;OK&quot; et enregistrer les résultats. </li></ol></li></ol></li><li> Exporter les résultats <ol><li> Exporter génotype appelle comme un tableur pour une analyse plus approfondie de la population de l&#39;échantillon. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Continu GRH est une étape d&#39;analyse post-PCR; par conséquent, l&#39;échantillon et de la configuration de test est similaire à des protocoles de PCR standard, avec l&#39;incorporation supplémentaire d&#39;un colorant fluorescent intercalant utilisé pour suivre le passage de la double-brin de l&#39;ADN simple brin pendant l&#39;étape de fusion de haute résolution. Le facteur le plus important pour l&#39;analyse de la GRH réussie est un produit de PCR robuste. Essai conception est la clé, et plusieurs outils optimisés pour la conception de l&#39;essai de la GRH sont disponibles dans le commerce et en ligne 13. Longueurs de amplicon de 80-150 paires de bases avec accompagnement ~ 20 paires de base bloqués sondes centrée sur le SNP ou SNP de travail de l&#39;intérêt supérieur de différencier SNP ainsi que haplotypes de multiples SNP dans la région de la sonde. Les sondes peuvent être bloquées en utilisant soit une terminaison 3 &#39;C3 espaceur ou une paire mésappariement de base 2 à l&#39;extrémité 3&#39;, qui empêchent l&#39;extension au cours de l&#39;amplification. Les sondes peuvent être conçus pour correspondre le brin Watson Crick ou modèle; le choixdépend de tests empiriques pour déterminer qui sonde la conception produit des pics de fusion acceptables. Excédent avant ou arrière amorces sont utilisées pour produire des produits d&#39;amplification simple brin qui apparie les sondes bloqués. Si la sonde contient la séquence du brin avant, puis amorce inverse est utilisé en excès, généralement dans un rapport de 1: 5, et vice-versa pour les sondes qui correspondent le brin inverse. De même, la GRH fonctionne mieux avec produit de PCR suffisante et robuste. PCR optimisation de la réaction nécessite des gels de gradient de PCR et agarose ou analyse Bioanalyzer pour déterminer les températures de recuit optimales. Modèle de concentration peut être augmentée en utilisant des procédés tels que la pré-amplification, amplification multiplexée biaisée de toutes les cibles à l&#39;aide de la concentration de l&#39;amorce et à faible nombre de cycles d&#39;augmenter la concentration de matrice 13. Seule une poignée d&#39;instruments sont compatibles avec MAAB. Les propriétés thermiques des tubes capillaires de verre i utilisésn ces systèmes facilitent cette méthode. Le petit diamètre intérieur des capillaires ainsi que le transfert rapide de la chaleur à travers le verre offrent un contrôle de température plus rigoureuses que plasticware PCR standard, qui a plus lents taux de transition entre les cycles de recuit et de dénaturation en raison des propriétés d&#39;isolation thermique des matières plastiques. Avec cette méthode, la sensibilité de détection peut être réduite de 2 à 5% à moins de 1% d&#39;un allèle mutant dans un mélange de type sauvage et mutantes 10 allèles. GRH est un outil facile, efficace et économique pour génotypage des SNP dans une variété de paramètres et de nombreuses applications, la surveillance des maladies infectieuses à la numérisation pour les variantes de gènes du cancer. Plusieurs autres instruments, comme la Roche Nano et systèmes LightCycler (480 et 96) ainsi que l&#39;Eco en temps réel offre système PCR GRH, en plus de l&#39;amplification standard, en temps réel, et la fonctionnalité du nombre de copies. Utilisant des machines plus débit, GRH codes-barres coûte less à 0,50 $ par test dans nos mains, y compris tous les réactifs et consommables. Dans le contexte décrit ici, les applications sur le terrain permettent la surveillance de la population en temps réel pour des changements associés aux efforts de lutte contre le paludisme, y compris réduction de la diversité de la population, la détection de types de parasites importés, et l&#39;apparition et la propagation de SNPs associés à la sensibilité de la drogue réduite. Améliorations à la méthode offrent une sensibilité supplémentaire utile pour informer les progrès vers l&#39;élimination du paludisme et de l&#39;éradication.

Malgré un regain d&#39;intérêt dans le contrôle du paludisme et de l&#39;éradication, le paludisme demeure un fardeau dans le monde, avec près de la moitié de la population mondiale au risque d&#39;infection et plus de 550.000 décès par an, en particulier les enfants en Afrique sub-saharienne 1. Ces nouveaux programmes de lutte et d&#39;éradication ont été soutenus par la renaissance génomique, avec un grand nombre de parasites du paludisme séquencé et analysé des mutations associées à une sensibilité réduite de drogue, une virulence accrue, et pour les caractéristiques de la population 2,3. Polymorphismes d&#39;un seul nucléotide (SNP) sont parmi les variantes génétiques les plus couramment identifiés 4-7. Méthodes de génotypage SNP portables offrent sur ​​place et la surveillance de la population en temps réel et de suivi 8. En plus d&#39;empreintes digitales individuelles parasites, le «code à barres moléculaire» est également utilisé pour détecter des décalages temporels spectaculaires de fréquence alléliqueainsi que la variance taille effective de la population et de la complexité de l&#39;infection 9. Bien que cet ensemble de informative SNP est facilement adaptable à de nombreuses plateformes de génotypage à haute résolution fusion (GRH) analyse est particulièrement bien adapté à sur le terrain des études, où le fonctionnement et la détection de nouvelles mutations à faible coût sensible et simple par rapport au séquençage et d&#39;autres les approches sont attrayants dans les milieux pauvres en ressources. HRM commence par réaction en chaîne par polymérase standard (PCR) qui incorpore un colorant fluorescent. Post-PCR analyse fusion détermine la température maximale amplicon de fusion; une seule différence SNP dans un court amplicon peut entraîner une importante température pic de fusion (Tm) des différences. Plusieurs améliorations apportées à cette méthode offrent une meilleure résolution pour différencier génotypage SNP y compris la classe IV (AT) SNP, et de détecter les allèles mutants mineures dans les échantillons avec de multiples allèles présents (polyGinfections enomic). Tout d&#39;abord, les tests incluent des sondes courtes centrés sur la région SNP en plus des amorces sens et antisens qui sont présents à des concentrations différentes. Ces sondes ne sont pas bloqués pendant la PCR amplifiés, mais se lient au brin produite au-delà du fait de concentrations d&#39;amorces asymétriques qui augmentent la production du produit sonde-modèle. Ces amplicons double brin distincts constitués de sonde liée à l&#39;excès de brin matrice sont ~ 20-30 pb; leur diminution significative longueur par rapport à l&#39;ensemble du amplicon (80-150 pb) conduisent à des différences beaucoup plus importantes Tm associés à une base unique ou multiple sonde modèle mal assortit 10. Deuxièmement, le biais de l&#39;amplification de l&#39;allèle mutant (MAAB) abaisse la température de recuit de réaction pour solliciter la réaction vers alleles mutants présents à de faibles taux dans les infections polygenomic. La température de recuit est fixé entre les Tm de (type sauvage) parfaitement adapté et dépareillés sonde (mutant)s. A cette température, la fixation de l&#39;allèle de type sauvage est suffisamment stable que l&#39;amplification est entravée par rapport à son équivalent de décalage, sollicitant ainsi l&#39;amplification vers l&#39;allèle mutant lorsque les deux sont présents dans un seul échantillon de 10. Avec ces améliorations en matière de GRH, cette technologie a permis le suivi des origines et de l&#39;identité des parasites associés à des infections épidémiques en Amérique du Sud 11 et la détection de nouvelles mutations, la différenciation de plusieurs SNP situés juste à côté de l&#39;autre dans l&#39;ordre, et les mutations présentes dans moins de 1 % des alleles dans les échantillons polygenomic 10. Augmentation de la sensibilité est particulièrement important dans les régions qui approchent le statut de pré-élimination et ceux à risque de résistance aux médicaments émergents. La capacité d&#39;identifier rapidement et facilement les parasites et les SNP importés associés à la sensibilité réduite sur site informe les efforts de surveillance et des programmes de contrôle au sujet del&#39;efficacité de leur mise en œuvre et identifie les points chauds pour l&#39;augmentation éradication du paludisme et d&#39;élimination efforts. Ce protocole décrit les méthodes de sonde bloquée repose-et MAAB pour une sensibilité accrue GRH de génotypage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Malgré des décennies d&#39;efforts d&#39;éradication, le paludisme demeure un fardeau mondial. Un regain d&#39;intérêt récent dans l&#39;élimination régionale et l&#39;éradication mondiale a été accompagnée par une augmentation de l&#39;information génomique sur les espèces parasite Plasmodium responsables du paludisme, y compris les caractéristiques des populations géographiques ainsi que les variations associées à une sensibilité réduite aux médicaments anti-paludéens. Une variation génétique commune, polymorphismes d&#39;un seul nucléotide (SNP), offre des cibles attrayantes pour génotypage du parasite. Ces marqueurs sont utiles non seulement pour le suivi des marqueurs de résistance aux médicaments, mais aussi pour le suivi des populations de parasites en utilisant des marqueurs ne relevant pas de la drogue ou d&#39;autres pressions sélectives. Méthodes de génotypage SNP offrent la possibilité de suivre la résistance aux médicaments ainsi que relever les empreintes digitales des parasites individuels pour la surveillance de la population, en particulier en réponse aux efforts de lutte contre le paludisme dans les régions en voie d&#39;éliminal&#39;état ionique. Alors que SNP informatifs ont été identifiés qui sont agnostiques aux technologies de génotypage spécifiques, à haute résolution de fusion (GRH) analyse est particulièrement adapté études basées champ à. Comparé aux méthodes standards fluorescente-Probe qui nécessitent SNP individuels dans une sonde marquée seule et offrent, au mieux, 10% de sensibilité pour détecter les SNP dans les échantillons qui contiennent plusieurs génomes (polygenomic), GRH propose 2-5% de sensibilité. Modifications à la GRH, tels que des sondes bloqués et les concentrations d&#39;amorces asymétriques ainsi que l&#39;optimisation de l&#39;amplification des températures de recuit biais PCR vers l&#39;amplification de l&#39;allèle mineur, augmentent encore la sensibilité de la GRH. Bien que l&#39;amélioration de la sensibilité dépend de la dosage spécifique, nous avons augmenté la sensibilité de détection à moins de 1% de l&#39;allèle minoritaire. Dans les régions qui approchent l&#39;éradication du paludisme, la détection précoce de l&#39;émergence ou la résistance aux médicaments importés est essentiel pour prOmpT réponse. De même, la capacité de détecter et de différencier les infections polygenomic types de parasites importés de réservoirs locaux cryptiques peut informer les programmes de contrôle. Ce manuscrit décrit les modifications à la technologie de fusion haute résolution qui augmentent encore sa sensibilité pour identifier les infections polygenomic dans les échantillons de patients.

Les données peuvent être visualisées de plusieurs manières différentes, en fonction du logiciel d&#39;analyse et l&#39;instrument. Typiquement, un tracé de la dérivée négative de la fluorescence normalisée par rapport à la température (-dF / dT) par rapport aux résultats de la température est la plus simple pour la visualisation de pics de fusion et de déterminer les génotypes. Une fenêtre de fusion complète (40 ° C-80 ° C) se traduira par deux régions d&#39;amplicon et de la sonde fusion. La figure 1 montre un exemple de pics de fusion normalisées pour les deux régions. Réglage de la fenêtre d&#39;analyse aux seuls résultats de la région de la sonde dans la différenciation claire des pics correspondant aux SNP spécifiques (Figure 2). Analyse basée sur une sonde montre clairement la présence de deux allèles que des pics individuels avec des températures de fusion qui correspondent à des pics SNP homozygotes (figure 3). La figure 4 montre que progressiréduire vement la température de recuit au cours de l&#39;amplification (Maab) se traduit par une préférence pour l&#39;allèle mutant (pic de gauche) (figure 4A), ce qui entraîne une sensibilité accrue pour l&#39;allèle mutant dans une population d&#39;allèles mixtes (figure 4B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figure 1. régions de sonde et amplicon fusion. Traçant la dérivée négative de la fluorescence normalisée par rapport à la température sur une large fenêtre de résultats de fusion à la fois la sonde (température inférieure) et des pics amplicon de fusion qui peuvent être analysés. (Adapté de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 2. Probe pics de fusion. Les matchs parfaits (typiquement des allèles sauvages) entraîner des pics de fusion plus élevés (en rouge), tandis que l&#39;inadéquation SNP ont des températures plus basses de fusion (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figure 3. Polygenomic pics de fusion. Lorsque les deux allèles sont présents dans un échantillon, l&#39;analyse de la gestion des ressources humaines basée sonde représente les deux allèles que les courbes de deux pics (orange) avec des pics qui correspondent à des échantillons individuels d&#39;un allèle (rouge et gris). (Adapté de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande v</a>ersion de ce chiffre. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figure 4. allèle mutant amplification biais (MAAB). A. Abaisser progressivement la température de recuit amplification biais de la réaction de pic de fusion vers pic correspondant à l&#39;allèle mutant (température plus basse) dans un échantillon ou polygenomic polyallélique. B. MAAB résulte de la sensibilité de la GRH pour détecter les allèles mineurs présents à moins de 1% dans les échantillons polygenomic ou polyallélique. (Partie B adapté de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Tableau 1. Set-up de haute résolution des réactions de fusion d&#39;amplification basés sur la sonde. <table><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume par rel&#39;action (plaque de 96 puits et un tube capillaire) </td><td> Volume par réaction (384 puits plaque) </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> GRH Master Mix </td><td> 4-5 pi </td><td> 2-2,5 ul </td><td> 1 fois </td></tr><tr><td> 10 x amorce en excès </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,50 uM </td></tr><tr><td> 10 x autre amorce </td><td> 1 ul </td><td> 0.5μl </td><td> 0,1 pM </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,40 uM </td></tr><tr><td> L&#39;eau qualité PCR </td><td> 1-2 pi </td><td> 0,5-1 ul </td><td></td></tr><tr><td> Patron de l&#39;ADN </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> De 0,01 à 10 ng / ul </td></tr><tr><td></td><td> 10 ul </td><td> 5 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. StandarD haute résolution conditions fusion d&#39;amplification. <table><tbody><tr><td> Température </td><td> Temps </td></tr><tr><td> Tenir </td><td> 95 ° C </td><td> 120 s </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 cycles </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 cycle </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sec </td></tr></tbody></table> * Cette température est amplicon-dépendante Tableau 3. Conditions amplification pour mutant biais allèle d&#39;amplification. <table><tbody><tr><td> Température </td><td> Temps </td><td> Cycles </td><td> Taux de rampe </td><td> Mode d&#39;acquisition </td><td> Mode d&#39;analyse </td></tr><tr><td> Dénaturer </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Aucun </td&gt; <td> Aucun </td></tr><tr><td rowspan="2"> Cycle </td><td> 95 ° C </td><td> 2 s </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Aucun </td><td rowspan="2"> Quantification </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sec </td><td> 20 </td><td> Unique </td></tr><tr><td rowspan="3"> Faire fondre </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sec </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0,3 </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sec </td><td rowspan="2"> Continu </td><td rowspan="2"> Faire fondre </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sec </td></tr></tbody></table> * Cette température est amplicon-dépendante et sera réduite lors de l&#39;exécution MAAB

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Bien que l&#39;analyse haute résolution de fusion offre la possibilité de différencier les polymorphismes nucléotidiques simples dans une population hétérogène, biais d&#39;amplification allèle mutant peut augmenter sa capacité à détecter les allèles présents à des pourcentages relativement faibles dans un échantillon. Ce protocole décrit des améliorations qui permettent d&#39;améliorer la sensibilité de l&#39;analyse de fusion de haute résolution.

Méthodes pour augmenter la sensibilité de la haute résolution de fusion Single Nucleotide Polymorphism génotypage dans le paludisme

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K vues.  Harvard University.  Bien que l'analyse haute résolution de fusion offre la possibilité de différencier les polymorphismes nucléotidiques simples dans une population hétérogène, biais d'amplification allèle mutant peut augmenter sa capacité à détecter les allèles présents à des pourcentages relativement faibles dans un échantillon. Ce protocole décrit des améliorations qui permettent d'améliorer la sensibilité de l'analyse de fusion de haute résolution. 

Vidéo: Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Recherche

Immunologie et infection

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Deux méthodes de formation hétérocaryons à découvrir les facteurs de restriction du VHC

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Peinture chromosomique 2D et 3D chez les moustiques du paludisme

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilisation de l&#39;Essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Haute résolution microscopie électronique de la<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag sécrétion de type IV Système Pili Produit dans différentes conditions de Fer Disponibilité

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de mesure de réponses immunitaires contre le paludisme dans le contexte du VIH co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Méthodes pour inhiber bactérienne Pyomelanin production et de déterminer l&#39;augmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Une méthode rapide pour le traitement du sang pour augmenter le rendement des niveaux peptidiques plasma dans le sang humain

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...