Nous tenons à remercier David R. Rodriguez, MA pour la conception graphique et la photographie dans ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un financement de la GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) et la subvention d&#39;appui Cancer Center (P30CA054174) à l&#39;installation UTHSCSA cytométrie de flux de base et le Fonds UTHSCSA avancée Nucleic Acids Core.

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Le test in vivo de mutagenèse in décrite ici est basée sur le modèle de souris transgénique LacI initialement généré par Kohler et al. 18 Ce modèle utilise un vecteur de phage λ portant un gène rapporteur lad. Les deux sites cos flanquant le vecteur permettre une relativement simple récupération et le conditionnement ultérieur en particules infectieuses de phages, utilisés pour infecter E. coli. Une plaque bleue sera généré par p...

Dans la plupart des tissus, des cellules différenciées ont une durée de vie limitée. Afin de maintenir l&#39;intégrité fonctionnelle, les cellules souches spécifiques de tissu à long terme produisent en continu des cellules souches qui à leur tour donnent naissance à des cellules complètement différenciées nécessaires à la fonction de ce tissu particulier. Les cellules souches reconstituer aussi leur propre compartiment par un processus appelé auto-renouvellement. Ainsi, les cellules souches sont responsables du maintien de l&#39;intégrité fonctionnelle des tissus ils résident po Par conséquent, il est impératif qu&#39;ils sont équipés de mécanismes solides pour détecter et potentiellement réparer l&#39;ADN endommagé. Sinon, ils peuvent acquérir de multiples perturbations génomiques (potentiellement dangereux), qui peuvent être hérités par leur progéniture. Comprendre comment les cellules souches sauve-garde de leur génome au cours de la durée de vie d&#39;un organisme est une question importante et peut nous aider à comprendre pourquoi l&#39;instabilité génomique est liée à un cancer et d&#39;autres maladies liées à l&#39;âge (examinés dans 1,2). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Contrôle de l&#39;intégrité du génome d&#39;un tissu au niveau des cellules souches ou des populations de cellules progénitrices précoce peut être obtenu soit en éliminant tige défectueuse (ou progénitrices) des cellules par l&#39;intermédiaire de la mort cellulaire, la sénescence ou la différenciation, et / ou par une réparation efficace ADN endommagé. Des études récentes ont montré qu&#39;il est possible de mesurer certains types de réparation de l&#39;ADN directement dans ces populations rares 6.3. On a constaté que, par exemple, dans le système hématopoïétique, les cassures double brin de l&#39;ADN peuvent être réparées par recombinaison homologue (RH) ou de la fin non homologue de jonction (NHEJ), ce dernier étant un procédé de réparation d&#39;une fidélité plus faible et donc une augmentation du risque de prise erreurs. Les deux sont utilisés dans des cellules souches hématopoïétiques (CSH) 4,5, cependant, chez la souris, il semble qu&#39;il est essentiellement NHEJ dans les CSH tandis que les cellules progéniteurs précoces utilisent HR 4. Une observation similaire a été faite pour les cellules souches dans la peau 6. Fait intéressant, dans les CSH humaines HR, pas NHEJ,semble être le mécanisme de réparation de choix pour des cassures double brin 3. Si cette différence fonctionnelle entre les deux espèces est réelle ou représente une différence technologique ou simplement expérimental reste à voir. Un répertoire de cellules souches pour réparer l&#39;ADN endommagé est susceptible d&#39;inclure d&#39;autres mécanismes de réparation d&#39;ADN, telles que l&#39;excision de base de réparation (BER), la réparation par excision de nucléotides (NER) et la réparation des mésappariements (MMR). BER et NER sont responsables de la réparation des lésions de paires de bases simples ou multiples dans l&#39;ADN simple brin, alors que l&#39;inadéquation des correctifs ROR base de base et des boucles d&#39;insertion / délétion; ces types de dommages à l&#39;ADN peuvent pas être réparés par NHEJ ou RH. L&#39;appui de cette notion existe plusieurs études provenant du système hématopoïétique qui démontre un lien entre les modifications dans l&#39;une de ces voies et des anomalies dans le compartiment HSC 7-9, ainsi qu&#39;un risque accru de développer un syndrome myélodysplasique 10-16, une maladie qui prend naissance dans laHSC et qui est associée à l&#39;augmentation de l&#39;instabilité génomique que la maladie progresse 17. Pour l&#39;instant, les mesures de BER, NER et MMR directement dans les CSH n&#39;ont pas été signalés. En plus d&#39;élucider les divers processus qui contrôlent l&#39;intégrité des tissus au niveau mécanique, il est impératif de pouvoir mesurer l&#39;ampleur de l&#39;ADN muté, de sorte que les conséquences d&#39;aberrations dans l&#39;un de ces processus peuvent être testés, par exemple dans la normale par rapport génétiquement cellules souches modifiées ou vieux par rapport à jeune. Cependant, le développement d&#39;un test pertinent est difficile en raison de la rareté des cellules souches tissulaires spécifiques et le manque de conditions de culture qui préserve &quot;caractère souche&quot;. En outre, une telle analyse devrait être amendée à des manipulations génétiques et environnementaux. Une solution possible à ces limitations et exigences est l&#39;utilisation de modèles de souris qui sont spécifiquement conçues pour détecter des mutations de l&#39;ADN. Muldes modèles de souris transgéniques tiples pour la détection de mutations ont été développés. Par exemple, des souris transgéniques 18 LacI porter un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène code pour un suppresseur LacI de l&#39;opérateur lac et sert de rapporteur de mutation. Lors de la mutation du gène LacI, l&#39;opérateur Lac est activé et β-galactosidase est produite. β-galactosidase clive le substrat chromogène X-gal (5-bromo-4-chloro-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), qui transforme le bleu. Les sites cos flanquant le vecteur Lacl permet une récupération facile par lambda protéines de phage et une infection ultérieure de E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat X-gal, plaques peut être marqué. Des plaques bleues contiennent un mutant putatif Lac-I portant un phage, alors que des plages claires abritent les non-mutants. La fréquence des plages bleues (e parmie ceux claires) indique la fréquence de mutants dans la population de cellules d&#39;origine de l&#39;ADN a été extrait à partir de. En outre, le phage λ accueillir la cible LacI peut être facilement séquencée en utilisant des techniques de PCR pour l&#39;analyse relativement à haut débit. Le séquençage des gènes multiples Laci mutants va révéler des informations importantes sur le spectre de mutation, qui à son tour peut pointer vers d&#39;éventuelles déficiences dans les voies spécifiques de réparation d&#39;ADN ou à des événements spécifiques génotoxiques. Le système transgénique Lad a été normalisé sur plusieurs laboratoires 19 et les réactifs sont disponibles dans le commerce. Un inconvénient majeur du système Lad est la capacité limitée pour détecter des délétions ou des réarrangements, par conséquent, d&#39;autres méthodes, par exemple FISH multi-couleur sur les spreads métaphase doivent être utilisés pour compléter cette lacune. Au sein du vecteur de phage λ du modèle de souris LacI, il existe un gène beaucoup plus petite, CII, Disponible pour l&#39;analyse des mutations. Sa taille et le fait que les mutants peuvent être sélectionnés en font un test de main-d&#39;œuvre et moins cher moins 20 que l&#39;analyse du gène Lad. Cependant, le gène LacI est plus largement étudié pour la mutagenèse 21 et la sensibilité du gène de mutations a été bien caractérisé de sorte qu&#39;il y ait une compréhension claire des résidus d&#39;acides aminés qui produisent une réponse phénotypique d&#39;un substrat chromogène de 22 à 25. D&#39;autres modèles de souris pour la détection de mutations incluent l&#39;utilisation de la ΦX174 ou les transgènes LacZ. Le modèle de souris transgénique ΦX174, avec le A initial: T → G: C réversion mutation dosage 26 ou le test de mutation directe 27 qui permet la détection d&#39;un spectre des substitutions de paires de bases, représente un système moins coûteux que le modèle Lad. Cependant, l&#39;écran de mutation dans le dosage de l&#39;avant n&#39;est pas anodin et la spécification de mutationtrum du transgène ΦX174 n&#39;est pas aussi bien caractérisé que celui de la LacI. Dans des modèles de souris portant des transgènes LacZ, le journaliste de mutation LacZ est récupéré en utilisant E. des cellules hôtes E. coli qui sont sensibles au galactose et un milieu contenant du galactose 28. Un inconvénient de ce système est que la récupération de la cible LacZ implique également la digestion d&#39;endonucléase de restriction suivie d&#39;une ligature et l&#39;électroporation de E. coli héberge, ce qui rend difficile d&#39;adapter le système pour de petits nombres de cellules. Bien que ce n&#39;est pas une exigence absolue pour travailler avec les populations de cellules souches / progénitrices (on peut toujours commencer avec plus souris), si un grand nombre de cellules sont nécessaires (par exemple, des millions ou plus), il deviendra vite impossible et un coût prohibitif. En outre, la taille relativement importante de LacZ, tout en offrant un reporter sensible mutationnelle, est lourd et plus coûteux pour une analyse de séquence d&#39;ADN et la détermination de spectres de mutation. Toutefois, un des grands avantages de ce modèle est sa capacité à détecter de grandes deletions et insertions, ainsi que des réarrangements chromosomiques. Etant donné que toutes les cellules dans les modèles de souris transgéniques LacI, ΦX174 et LacZ portent le système rapporteur, l&#39;un de ces modèles de souris peut être utilisée pour mesurer la mutagenèse dans n&#39;importe quel type de cellule d&#39;intérêt, y compris des cellules souches et progénitrices, tant qu&#39;ils peuvent être récoltées de façon fiable et en nombre suffisant. Parce que nous avions une grande expérience avec le modèle de la souris Lad et le test de mutation Lad, nous avons décidé de poursuivre encore ce système pour l&#39;analyse de mutagenèse dans souches hématopoïétiques et populations de cellules progénitrices. Le tissu hématopoïétique est bien caractérisée en termes de phénotype de surface cellulaire de ses composants individuels, y compris les cellules de repopulation à long terme souches, qui sont identifiables comme la population extrêmement rare de Lin - IL7R <sup&gt; - Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - 29 cellules. . Mohrin et al 4 ont démontré que la population légèrement plus grand de LSK/Flk2 - cellules sont encore bons représentants pour les CSH et significativement différent de l&#39;ancêtre myéloïde engagé plus primitive (CMP) de la population quand il s&#39;agit de l&#39;étude de réparation de l&#39;ADN. En outre, lorsque le LSK HSC enrichi (Flk-2 + et Flk-2 -) des cellules ont été comparés à la Lin - IL7R - Sca-1-cKit + (cellules progénitrices LS-K) +, il y avait encore une différence significative dans NHEJ capacité 5 entre le moins pur, de la tige de LSK population enrichie en cellules, et les cellules progénitrices. Dans notre étude, nous utilisons HSC enrichi LSK (Flk-2 + et Flk-2 -) des cellules parce que nous avons constaté qu&#39;au moins 2 x 10 5 cellules sont nécessaires pour des résultats cohérents et fiables dans ce test de mutagenèse; ce numéro de cellule est extrêmement difficileà obtenir quand on trie le LSK/Flk2 - population CD150 + CD48 ou même la LSK/Flk2 - population (en termes de souris, les coûts et pratique). Ce protocole, sur la base de celui initialement mis au point par Kohler et al. 18 décrit en détail la façon dont la fréquence de mutants spontanés d&#39;ADN peut être déterminée dans des cellules LSK et des populations de cellules myéloïdes différenciées ainsi que des cellules de moelle osseuse non séparée et la rate définie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

Au cours des dernières années, il est devenu évident que l&#39;instabilité génomique est étroitement liée à de nombreux troubles du développement, des cancers et de vieillissement. Étant donné que les cellules souches sont responsables d&#39;assurer l&#39;homéostasie tissulaire et la réparation tout au long de la vie, il est raisonnable d&#39;émettre l&#39;hypothèse que la population de cellules souches est essentielle pour la préservation de l&#39;intégrité du génome de tissus. Par conséquent, beaucoup d&#39;intérêt a été soulevée dans l&#39;évaluation de l&#39;impact des facteurs endogènes et environnementaux sur l&#39;intégrité du génome dans les cellules souches et leur progéniture, visant à comprendre l&#39;étiologie des maladies à base de cellules souches. Souris transgéniques lacI portent un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène LacI sert de rapporteur de mutation. Le résultat d&#39;un gène muté LacI est la production de β-galactosidase qui clive un substrat chromogène, le tournant dans le bleu. Le système rapporteur Lad est réalisée in toutes les cellules, y compris les cellules souches / progénitrices et peuvent facilement être récupérés et utilisés pour infecter ensuite E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat correct, plaques peut être marqué; plaques bleues indiquent un gène mutant Lad, tandis que les plaques claires abritent de type sauvage. La fréquence de bleu (entre les plaques claires) indique la fréquence de mutation dans la population de cellules d&#39;origine de l&#39;ADN a été extrait à partir de. Le séquençage du gène mutant LacI affiche l&#39;emplacement des mutations dans le gène et le type de mutation. Le modèle de souris transgénique Lad est bien établi comme un test in vivo de mutagenèse. En outre, les souris et les réactifs pour le test sont disponibles dans le commerce. Nous décrivons ici en détail comment ce modèle peut être adapté pour mesurer la fréquence d&#39;apparition spontanée de mutants d&#39;ADN dans les cellules souches enrichie en cellules Lin - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) et d&#39;autres sous-populations de cellules du système hématopoïétique.

<html> Le test in vivo de mutagenèse mesure un événement rare (mutant UFP) parmi beaucoup d&#39;événements (UFP). En effectuant le dosage avec un petit nombre de cellules, il est possible que le résultat est considérablement influencée par des résultats faux-positifs et faux-négatifs. Pour répondre à cette question nous avons réalisé une expérience de dilution en série avec des cellules de moelle osseuse non fractionnées, récoltées à partir de trois animaux différents. Nous avons mesuré la ...

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Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells | Immunology and Infection | Video

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d&#39;ADN spontanément surgi ou après l&#39;exposition à génotoxines.

Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

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12.9K vues.  UT Health Science Center at San Antonio.  Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines. 

Vidéo: Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

L&#39;identification des gènes induite par une dysrégulation de Kaposi associé au sarcome de Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

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Immunologie et infection

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Induction et d&#39;évaluation de la recombinaison commutateur de classe dans purifiée cellules B murines

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sept étapes pour Stellate Cellules

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Génération de cellules T spécifiques Multivirus pour prévenir / traiter les infections virales, après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d&#39;EAE chronique

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualiser les interactions protéine-ADN dans des cellules bactériennes vivantes en utilisant photoactivés suivi unique molécule

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...