Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de la santé de subvention # 1R01CA120825-01A1, la recherche biomédicale en collaboration (PRC) de l&#39;Université du Massachusetts à Amherst, et la bourse Isenberg pour Bhushan J. Toley. Nous tenons à souligner la précieuse contribution de James Schafer, le vidéaste, le narrateur, et rédacteur en chef de cette vidéo.

1. Fabrication de périphériques La réplication des caractéristiques microfluidiques dans les matériaux élastomères est basée sur la méthode décrite par Duffy et al 1. <ol><li> Élastomère Mix (polydiméthylsiloxane; PDMS) et l&#39;agent de durcissement à partir du Kit élastomère de silicone (Dow Corning, Midland, MI) dans un rapport pondéral de 9:1 à verser sur le maître pour former une couche de 4 mm d&#39;épaisseur. Dégazer pour enlever les bulles d&#39;air et durcir le mélange à 60 ° C pendant 5 heures. Peler durcie du moule PDMS pour obtenir un tampon de caractéristiques d&#39;écoulement de l&#39;élastomère. </li><li> Percez des trous pour les entrées et les sorties à l&#39;aide d&#39;une biopsie de 1,5 mm (Miltex, York, PA) monté sur une perceuse à colonne. Retirez tout débris. </li><li> Soumettre le côté caractéristiques du timbre et une lame de verre propre à un plasma d&#39;oxygène pendant 8 minutes dans un plasma d&#39;oxygène graveur. Amener les surfaces traitées en contact immédiatement pour former une liaison entre eux. Maintenir l&#39;ensemble à 60 ° C sur une lame chaude pendant au moins 5 heuress pour renforcer le lien. </li><li> Connectez 0.032 &quot;ID Tuyau en PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) pour les entrées et sorties à l&#39;aide d&#39;une interface de connecteurs luer lock mâle attaché à barbelés connecteurs femelles luer lock (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Mettre en place l&#39;ensemble d&#39;écoulement à l&#39;aide robinets et un connecteur en Y (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Figure 1). Monter l&#39;appareil sur le microscope. Fixer seringues de tubage à l&#39;aide 20G 1.5 &quot;aiguilles (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Formation de sphéroïdes uniformes Sphéroïdes sont formées par la méthode de la goutte suspendue 2,3. <ol><li> Trypsiniser cellules sous une hotte de culture cellulaire stérile. </li><li> Centrifuger les cellules trypsinisées à 2000 rpm pendant 5 minutes et remettre en suspension dans 6 ml de milieu frais. Diluer la solution mère à une concentration finale désirée (tableau 1). </li><li> Retirez le couvercle d&#39;une plaque de 48 puits et placez-le à l&#39;envers dans le sterilized capot. Régions circulaires correspondant à chaque puits sont apparents sur la couverture. Remplir chaque puits de la plaque avec 1 ml d&#39;eau stérilisée pour maintenir l&#39;humidité. Mettez une goutte de 20 ul de la solution diluée de cellules dans chaque région circulaire à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Retourner avec précaution le couvercle et placez-le sur la plaque ainsi, faire en sorte que les gouttes ne touche pas les bords des puits. </li><li> Incuber la plaque de puits à 37 ° C pendant un nombre spécifié de jours (tableau 1). Un sphéroïde se former dans chaque goutte suspendue. </li></ol> 3. Introduction de sphéroïdes dans le dispositif Reportez-vous à la figure 1 et le tableau 2 pour cette section. <ol><li> Stériliser le dispositif de rinçage avec de l&#39;éthanol 70% introduit à travers l&#39;entrée d&#39;écoulement. Par la suite, rincer avec du PBS suivie d&#39;HEPES tampon milieu de culture cellulaire. Laisser la seringue moyen F S attaché à la tubulure. </li><li> Dessinez 2-3 sphéroïdes en P seringue S, appuyez sur la seringue pour éliminer les bulles d&#39;air, etattacher à l&#39;entrée du dispositif d&#39;emballage. </li><li> Ouvert entrée de la vanne V Pin et près Fin V. Ouvrir la vanne de sortie Pout V et V près Fout. Tenez la seringue d&#39;emballage verticale avec l&#39;aiguille pointée vers le bas; regarder sphéroïdes se déposent au fond de la seringue dans le connecteur luer-lock de l&#39;aiguille. Poussez le piston de la seringue d&#39;emballage et de sphéroïdes montres entrer dans le tube et le débit dans l&#39;appareil. Parce que la vanne de sortie emballage est ouvert, un sphéroïde pénètre dans la chambre de l&#39;appareil et être conservé par les postes à l&#39;arrière (Fig. 2). </li><li> Fermer entrée de la vanne V Pin et Pout sortie de la vanne V. Monter la seringue S F sur une pompe à seringue. Ouvrir le robinet et la vanne V Fin V Fout. Type de fluide dans le dispositif à 3 pi / min. </li></ol> 4. Présentation de l&#39;agent apoptose de détection (CaspGLOW) Après l&#39;emballage des chambres avec sphéroïdes, pour permettre l&#39;équilibrage up à 24 heures pour établir des gradients de nutriments et micro-environnements, avant l&#39;introduction de l&#39;apoptose ou de la détection d&#39;agents thérapeutiques. Parce que les tissus dans des chambres sont en contact avec des murs impénétrables du haut et du bas, il n&#39;ya pas de gradients de nutriments le long de l&#39;épaisseur (0,15 mm) du tissu. Après 24 heures d&#39;incubation, les couches de cellules le long de l&#39;épaisseur du tissu est donc équivalent et que l&#39;hétérogénéité est dans une direction s&#39;éloignant du canal d&#39;écoulement. <ol><li> Couper V Fin, arrêter la pompe seringue, retirez F seringue S de la pompe et la remplacer par une seringue ayant moyennes contenant 0,25 ug / ml de CaspGLOW Red active Caspase-3 marqueur (rouge-DEVD-FMK, Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Vider manuellement les 0,7 ml de cette solution à travers le dispositif pour assurer le déplacement des personnes âgées à moyen terme. Monter la seringue de la pompe, redémarrez l&#39;écoulement, et ouvert V Fin. Sur une période de 5-8 heures, la détection de l&#39;apoptose diffuse agents en til tissu fluorescent et lumineuses dans les régions apoptotiques. Agent de l&#39;apoptose détecter à cette concentration est maintenue dans toutes les solutions de flux ultérieurs dans le dispositif. </li></ol> Note: <ol class="lroman"><li> L&#39;hétérogénéité des tissus peut être confirmé par l&#39;obtention de profils d&#39;intensité de fluorescence linéaire tel que décrit dans la section 6. Les profils doivent montrer gradients spatiaux dans l&#39;apoptose, ce qui confirme que le tissu est hétérogène en ce qui concerne la viabilité des cellules. </li><li> CaspGLOW vert active Caspase-3 marqueur (fluorescéine-DEVD-FMK, Biovision) peuvent également être utilisés pour détecter l&#39;apoptose. Ce marqueur contient la fluorescéine fluorophore vert au lieu de la rhodamine fluorochrome rouge. </li></ol> 5. Présentation de l&#39;agent thérapeutique <ol><li> Suivez la procédure des étapes 4.1 à 4.2 pour introduire 10 uM chlorhydrate de doxorubicine (Dox; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contenant l&#39;apoptose agent de détection. </li><li> Continuer écoulement du therapeUTIC solution d&#39;agent pendant une période de temps déterminée. Vanne d&#39;arrêt V Fin et éteindre la pompe à seringue. Remplacez la seringue traitement avec une seringue contenant un milieu frais apoptose agent de détection. Permettre l&#39;écoulement du milieu frais pendant 24 -36 heures tout en surveillant continuellement les tissus au microscope. </li></ol> 6. Time-lapse de microscopie et estimation des coefficients Diffusivité médicaments Pour obtenir plus propres données de fluorescence, d&#39;acquérir toutes les images en mettant l&#39;accent sur le microscope les basses couches de tissus. Parce qu&#39;il n&#39;y a pas de gradients de nutriments dans le sens vertical (voir la section 4), les couches inférieures de cellules sont de bons représentants de toutes les autres couches ci-dessus. <ol><li> Le processus d&#39;acquisition a été automatisé en utilisant un script personnalisé dans IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Acquérir des images transmises lumière et de la fluorescence du sphéroïde emballé à un grossissement de 10x toutes les 30 minutes (figure 3A). Acquire une image de la fluorescence de fond avant l&#39;introduction de Dox. Pour tenir compte de la grande taille de la chambre (1000 x 300 um um), l&#39;acquisition de deux images adjacentes et les tuiles ensemble 4. </li><li> Pour l&#39;estimation mathématique des coefficients de diffusivité de drogue, la première étape consiste à générer des profils d&#39;intensité moyennes linéaires de Dox fluorescence en utilisant ImageJ. Sélectionner une région rectangulaire d&#39;intérêt (ROI) entourant le tissu dans la chambre. Utilisez la commande Profil Terrain pour générer un profil d&#39;intensités moyennes en fonction de la distance entre le canal d&#39;écoulement. Répétez l&#39;opération pour jusqu&#39;à 3 points de temps différents. </li><li> Obtenir une image de fluorescence de fond avant l&#39;introduction Dox pour mesurer l&#39;autofluorescence de tissu. Soustraire l&#39;intensité de fond de fluorescence moyenne des profils d&#39;intensité obtenus et normaliser chaque profil correspondant à l&#39;intensité maximale pour obtenir <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" /> (X, t) (Fig. 3B). </li><li> L&#39;étape suivante consiste à évaluer l&#39;efficacité coefficient de diffusion D de Dox au sein du tissu tumoral. Dox diffusion peut être représentée par l&#39;équation suivante 5 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1"/> où erfc est la fonction d&#39;erreur complémentaire, x est la distance dans le tissu de la chaîne, et t est le temps après l&#39;introduction de Dox (voir Fig. 3). Utilisez le schéma itératif suivant à chaque point de temps considéré: <ul><li> Devinez une valeur de D </li><li> Calculer côté droit de l&#39;équation à chaque position x </li><li> Calculer la somme des carrés des erreurs (résiduelle) entre les deux parties </li><li> Modifier D pour minimiser le résidu </li></ul></li><li> Moyenne des valeurs optimales de D obtenue à chaque point temporel pour estimer le coefficient de diffusion effectif moyen de Dox dans le tissu. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: &lt;p = classe &quot;jove_content&quot;&gt; Les dispositifs microfluidiques fourni 1mm x 0,3 mm x 0,15 mm optiquement chambres de culture accessibles pour la croissance de tissu tumoral à trois dimensions. Sphéroïdes tumoraux multicellulaires ont volé dans ces chambres et ont été retenus par deux postes de filtre à l&#39;arrière. La méthode de la goutte suspendue a permis la formation rapide de sphéroïdes de taille uniforme et la forme de plusieurs lignées cellulaires. Sphéroïdes ont été cultivées avec succès sur l&#39;appareil pour un maximum de 3 jours. La croissance dans les chambres a été associée à une modification reproductible des micro-environnements au sein de sphéroïdes. L&#39;apoptose dans les cellules ont été moins à proximité du canal d&#39;écoulement et plus profondément dans les tissus. Le dispositif a été utilisé pour estimer le coefficient de diffusion de la doxorubicine dans le tissu tumoral. La valeur obtenue de 8,75 x 10 -7 cm -1 2 s est en accord avec la valeur de 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 signalé précédemment 6 dans le cancer du sein humain. <table border="1"><tbody><tr><td> Lignée cellulaire </td><td> Concentration cellulaire nécessaire </td><td> Temps d&#39;incubation </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 cellules / uL </td><td> 2-3 jours </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 cellules / uL </td><td> 3-4 jours </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 cellules / uL </td><td> 5-6 jours </td></tr></tbody></table> Tableau 1 Paramètres. Pour Sphéroïdes goutte suspendue <table border="1"><tbody><tr><td> Partie </td><td> Description </td></tr><tr><td> S F </td><td> Seringue flux </td></tr><tr><td> S P </td><td> Emballage seringue </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Soupape d&#39;admission de flux </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Emballage soupape d&#39;admission </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Vanne de sortie de flux </td></tr><tr><td> Pout V </td><td> Emballage vanne de sortie </td></tr></tbody></table> Seringues Tableau 2. Vannes et dans la configuration de débit <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 Schéma de l&#39;écoulement de l&#39;installation V et V Fin Fout:. Entrée de débit et de vannes de sortie; V Pin et Pout V: entrée d&#39;emballage et de soupapes d&#39;échappement; S F et S P: Débit et des seringues d&#39;emballage. La seringue d&#39;emballage et de conditionnement soupapes d&#39;admission et de sortie sont utilisés lors d&#39;un sphéroïde est effectué dans la chambre. La seringue d&#39;écoulement et de débit d&#39;entrée et valves de sortie sont utilisés pour s&#39;écouler ensuite milieu. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Schéma d&#39;un sphéroïde pris au piège dans une chambre sur l&#39;appareil. Un sphéroïde s&#39;écoule dans la chambre de l&#39;appareil et est bloqué par deux pos filtrect à l&#39;arrière de la chambre. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Diffusion doxorubicine dans le tissu tumoral sur l&#39;appareil. A. Fusionné transmise image lumineuse et fluorescente rouge de tissu, indiquant l&#39;emplacement et la concentration de doxorubicine (en rouge). La barre d&#39;échelle représente 250 um. B. Profil normalisé intensité linéaire de la fluorescence de la doxorubicine.

<ol>
	<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly(dimethylsiloxane).">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro.">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li><li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics.">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li><li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer.">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li><li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma:+branching+patterns+and+vessel+dimensions.">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li><li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+physiology+of+solid+tumors:+opportunities+(and+problems)+for+cancer+therapy.">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La vascularisation des tumeurs sont rares et mal développés 7,8. Il ya des régions éloignées (&gt; 100 um) à partir des vaisseaux sanguins qui sont inaccessibles aux nutriments et les médicaments fournis si le 9 vasculaire. Le micro-environnement hétérogène résultant contribue à l&#39;efficacité limitée de plusieurs agents chimiothérapeutiques 10. Le dispositif microfluidique développée ici recrée un microenvironnement tumoral hétérogène, caractérisée par la prolif...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Kit d&#39;élastomère de silicone </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biopsie </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1,5 mm </td></tr><tr><td> Tuyau PTFE </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06417-31 </td><td> 0.032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Connecteur Luer mâle de verrouillage </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Barbed connecteur luer lock femelle </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Vanne d&#39;arrêt </td><td> Idex la santé et des sciences </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-connecteur </td><td> Idex la santé et des sciences </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;aiguilles </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW fluorescéine </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Rouge </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhydrate de doxorubicine </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Lignée cellulaire humaine de carcinome du côlon </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Ligne d&#39;Ductal cellulaire Carcinome </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Human ligne cellulaire d&#39;adénocarcinome mammaire </td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

Nous avons développé un dispositif microfluidique qui imite la livraison et la clairance systémique de médicaments hétérogènes tridimensionnels tissus tumoraux in vitro. Les éléments nutritifs fournis par le système vasculaire ne parviennent pas à atteindre toutes les parties de tumeurs, ce qui donne lieu à des micro-environnements hétérogènes constitués de types de cellules viables, de repos et nécrotiques. Médicaments contre le cancer ne parviennent pas à pénétrer efficacement et de traiter tous les types de cellules en raison de cette hétérogénéité. Des monocouches de cellules cancéreuses ne pas imiter cette hétérogénéité, il est difficile de tester des médicaments anticancéreux avec un modèle in vitro approprié. Nos dispositifs microfluidiques ont été fabriquées à partir de PDMS en utilisant la lithographie douce. Multicellulaires sphéroïdes tumoraux, formées par la méthode de la goutte suspendue, ont été insérés dans des chambres de contrainte et rectangulaires sur le dispositif de perfusion et maintenu à support continu sur un côté. La forme rectangulaire des chambres sur le dispositif créé dégradés linéaires dans les tissus. Colorants fluorescents ont été utilisés pour quantifier ela variabilité e dans l&#39;apoptose dans les tissus. Les tumeurs de l&#39;appareil ont été traités avec la doxorubicine fluorescente chimiothérapeutique drogue, time-lapse microscopie a été utilisé pour contrôler sa diffusion dans les tissus, et le coefficient de diffusion effectif a été estimé. La méthode de la goutte suspendue a permis la formation rapide de sphéroïdes uniformes de plusieurs lignées de cellules cancéreuses. Le terminal est activée croissance des sphéroïdes pour un maximum de 3 jours. Les cellules se trouvant à proximité de faire circuler l&#39;agent apoptotique sont très peu et loin de ceux de la chaîne sont plus apoptotique, ainsi fidèlement imitant les régions adjacentes dans les tumeurs des vaisseaux sanguins. La valeur estimée du coefficient de diffusion d&#39;accord avec la doxorubicine une valeur précédemment rapportés dans le cancer du sein humain. Parce que la pénétration et la rétention de médicaments dans les tumeurs solides affecte leur efficacité, nous pensons que ce dispositif est un outil important pour comprendre le comportement de la drogue, et qui développe des thérapies contre le cancer.

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Nous présentons la procédure pour la fabrication et le fonctionnement d&#39;un dispositif microfluidique qui recrée hétérogènes micro-environnements tumoraux<em&gt; In vitro</em&gt;. La variabilité dans l&#39;apoptose au sein du tissu tumoral a été quantifiée en utilisant des colorants fluorescents et le coefficient de diffusion effectif de la doxorubicine médicament chimiothérapeutique dans le tissu tumoral a été évalué.

Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K vues.  University Of Massachusetts Amherst. Nous présentons la procédure pour la fabrication et le fonctionnement d'un dispositif microfluidique qui recrée hétérogènes micro-environnements tumoraux In vitro. La variabilité dans l'apoptose au sein du tissu tumoral a été quantifiée en utilisant des colorants fluorescents et le coefficient de diffusion effectif de la doxorubicine médicament chimiothérapeutique dans le tissu tumoral a été évalué.

Vidéo: Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Un dispositif microfluidique pour l&#39;étude de plusieurs souches distinctes

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Recherche

Bio-ingénierie

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingénierie tissulaire de la tumeur stromale Microenvironnement avec application de Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse Inhomogénéité mélange dans un dispositif microfluidique par Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Mise en place d’un dispositif microfluidique pour la production de bouchons combinatoires

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Pleins feux sur l’auteur : Intégration des approches computationnelles et expérimentales en oncologie de précision

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Dispositif microfluidique bicouche pour la production de bouchons combinatoires

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...