Notre protocole décrit l’utilisation de dyes BODIPY conventionnelles pour la microscopie à super résolution à l’aide de leurs états clairsemés et décalés en rouge. Cela nous permet d’étudier les organites et les biomolécules dans les cellules vivantes avec une résolution de 30 nanomètres. L’avantage de cette méthode est sa simplicité et la polyvalence des différents conjugués BODIPY disponibles qui fournissent une source durable de signaux molécule unique.
Notre application démontrée pourrait devenir importante pour obtenir des perspicacités dans des maladies telles que la maladie hépatique grasse ou le diabète de type 2 en résolvant des gouttelettes de lipide et des acides gras au-dessous de la limite de diffraction. Nous prenons connaissance de la biologie des gouttelettes d’acides gras et de lipides dans les cellules de levure et de mammifères. Toutefois, cette technique s’applique à tous les autres types de cellules transparentes à faible fluorescence de fond.
Lors de l’utilisation de la technique pour la première fois, assurez-vous d’optimiser les concentrations di et les pouvoirs laser, pour observer les signaux lumineux molécule unique. Une démonstration visuelle de cette technique est importante pour voir comment la concentration di et l’optimisation de la puissance laser se traduit par des signaux lumineux molécule unique. Maintenir les cellules U2OS mammifères dans le DMBM non fluorescent avec 10% sérum bovin fœtal quatre millimolaire glutamine, un pyruvate millimolaire de sodium, et un pour cent antibiotiques de streptomycine de pénicilline dans un flacon de T-25.
Diviser les cellules à 70 à 80% de confluence à un à cinq, et pipette dans un seul puits d’une plaque de huit puits. Modifier les cellules dans la plaque de huit puits pendant 12 à 24 heures. Dix minutes avant l’imagerie, ajoutez un bodipy-C12 Lysotracker vert ou l’autre conjugué BODIPY, ajoutez une concentration finale de 100 nanomolaires.
Montez les ensembles de filtre appropriés dans le chemin d’émission en fonction de la couleur d’émission de BODIPY utilisée. Allumez le microscope. Microscope, 488 nanomètres et 561 nanomètres lasers, ainsi que la caméra.
Ajouter une goutte d’huile émergente sur l’objectif du microscope. Ouvrez le logiciel HAL4000 qui contrôle la lumière LED pour l’imagerie par champ lumineux, les puissances laser, les volets laser et les paramètres de la caméra pour l’imagerie. Réglez le gain EMCCD à 30 et la température de la caméra à moins 68 degrés Celsius.
Préparez la caméra et le logiciel correspondant pour enregistrer des films à 20 Hertz. Allumez le chauffe-scène au microscope et réglez-le à une température de 37 degrés Celsius et à un niveau de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Ajustez la couleur de correction objective en conséquence.
Montez l’échantillon au stade du microscope et concentrez-vous jusqu’à ce que le système de focalisation s’engage. Déplacez la scène à l’aide du contrôleur de scène jusqu’à ce que des cellules saines apparaissent dans le champ de vision. Chargez les séquences d’obturateur laser pour l’excitation du monumus ainsi que des gradateurs, à qui la puissance laser du laser de 561 nanomètres à entre 821 kilowatts par centimètre carré pour une microscopie de localisation de molécule unique, de sorte que, les pores de fluorescence de molécule unique sont détectés dans le canal d’émission red-shifted.
Réglez la puissance laser entre le point 035 et le point 07 watts par centimètre carré pour le laser de 488 nanomètres, de sorte que la fluorescence conventionnelle apparaît dans le canal d’émission vert. Choisissez un dossier de destination pour les films et enregistrez 5000 à 20000 images d’acquisition pour collecter suffisamment de localisations pour reconstruire des images de super résolution. Déplacez-vous vers différents champs de vision et répétez pour collecter des données pour plus de cellules.
Chargez le film dans un logiciel d’analyse de microscopie de localisation d’une seule molécule. Filtrer visuellement le film et ajuster les paramètres de contraste, de sorte qu’une seule molécule fluorescente clignote est visible. Définir des paramètres d’identification à molécule unique pour l’ajustement des Gaussiens 2D, PSF.
Filtrer visuellement à travers quelques images d’exemple pour vérifier les paramètres d’identification, et détecter de manière fiable les éclats fluorescents à molécule unique distincte. Analyse de presse pour effectuer une microscopie de localisation molécule unique imaginer l’analyse avec les paramètres d’identification optimisés. Et puis, rendre chaque molécule unique comme un Gaussian 2D dont la largeur est pondérée par la racine carrée inverse du nombre détecté de photons.
Évaluer la qualité des données. Utilisez des plages d’images restreintes pour observer les distributions d’une seule molécule à des cas et à un moment plus spécifiques. Cela explique le mouvement des organelles lors de l’acquisition de données.
Dans cette étude, nous avons présenté une procédure optimisée de préparation d’échantillon, d’acquisition et d’analyse de données avec la microscopie de localisation de molécule simple utilisant des conjugués bodipy. Pour démontrer un exemple du flux de travail pour l’acquisition et l’analyse des données de microscopie de localisation d’une molécule unique, BODIPY dans la levure a été employé pour résoudre des gouttelettes de lipide au-dessous de la limite optique de diffraction. Des exemples des différents modes d’imagerie multicolore de BODIPY en conjugaison avec d’autres sondes telles que GFP et mEos2 sont montrés ici.
BODIPY-C12 s’est formé dans les grappes mobiles de gouttelettes non lipidiques dans la périphérie cellulaire au jeûne, contrairement à leur incorporation dans les gouttelettes lipidiques dans des conditions nourries. Pour étendre davantage la capacité de microscopie de localisation à molécule unique des conjugués BODIPY aux cellules mammifères, BODIPY-C12 et Lysotracker vert dans les cellules U2OS vivantes ont été photographiés. L’optimisation de la concentration bodipy ainsi que passionnant les puissances laser sont des étapes critiques afin de visualiser les signaux lumineux molécule unique, et de reconstruire des images de super résolution.
Cette méthode peut être utilisée avec n’importe quel autre conjugué BODIPY pour obtenir une perspicacité à haute résolution, dans la distribution temporelle spéciale de bio-molécules spécifiques à l’intérieur des cellules vivantes. Notre technique a ouvert la voie, pour interroger davantage la gouttelette lipidique et la biologie des acides gras à l’échelle des lentilles nanoscopiques. Toutefois, cette application va bien au-delà des philopectetes spécifiques en raison de la disponibilité de divers conjugués BODIPY fonctionnels.
S’il vous plaît assurez-vous de suivre les procédures d’exploitation standard pour la manipulation des échantillons biologiques et des téiures, et aussi être nos haies obligatoires et suivre les procédures de sécurité laser.
