The project was supported by CTSA (UL1TR000058) from the National Center for Advancing Translational Sciences) and the CCTR Endowment Fund of Virginia Commonwealth University. The contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent official views of the National Center for Advancing Translational Sciences or the National Institutes of Health.

Toutes les procédures sang dessin doivent être effectués par des professionnels agréés et certifiés. L&#39;utilisation de sujets humains pour la recherche implique l&#39;approbation de l&#39;Institutional Review Board ou toute autre autorité appropriée. Précautions particulières concernant le consentement éclairé et la protection de l&#39;identification des participants doivent être suivies. Toutes les expériences énoncés dans ce Protocole impliquent la manipulation du sang humain et / ou de produits sanguins et de l&#39;équipement de protection individuelle approprié doivent être portés à tout moment. Les déchets doit être considérée comme Biohazard et éliminés conformément aux règlements. 1. ponction veineuse <ol><li> Identifier le patient / participant et confirmer avec les documents existants. Expliquer l&#39;étude en détail et obtenir un consentement éclairé. </li><li> Avoir un plateau mis en place pour chaque patient avec des tubes marqués sur une surface plane et stable. </li><li> Expliquer la procédure et de faire le siège du patient confortablement avec le bras soutenu. Informer le patient qu&#39;il ou she vous sentirez une petite pincée et devrait le rester encore pendant toute la procédure. </li><li> Fixez l&#39;aiguille à l&#39;adaptateur. </li><li> Se laver les mains et porter des gants. </li><li> Préparer le pli du coude pour ponction veineuse par un nettoyage avec 70% d&#39;alcool isopropylique en cercles concentriques à partir du centre vers l&#39;extérieur. Autoriser le site sécher à l&#39;air pendant 30 sec. </li><li> Identifier la veine appropriée par palpation. </li><li> Appliquer le garrot 3-4 au-dessus du site de ponction en vous assurant qu&#39;il est pas trop serré (tout en sentant le pouls radial). </li><li> Effectuer la ponction veineuse en insérant le biseau de l&#39;aiguille 15-30 degrés à la peau dans un mouvement fluide. Appuyez sur le tube de collecte de sang à travers l&#39;aiguille et recueillir 9 ml de sang entier. </li><li> Retirez le garrot. Enlevez le tube de l&#39;aiguille. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et appliquer le carré de gaze sur le site de ponction avant le retrait de l&#39;aiguille. Jeter l&#39;aiguille dans un container prévu appropriée. </li><li> Demandez au patient de maintenir prEssure au site de ponction. </li><li> Etiqueter les tubes </li><li> Consultez le site de ponction pour être sûr saignement a cessé. </li><li> Appliquer un bandage ou un ruban adhésif sur la place de la gaze, demander si le patient se sent bien (pas de douleur, un gonflement ou des étourdissements) </li><li> Merci le patient / participant avant de les rejeter. </li></ol> 2. Préparation de L-PRF <ol><li> Immédiatement après le prélèvement de sang veineux dans le tube rouge surmonté verre sec, placez-le dans la centrifugeuse. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 12 min à température ambiante après avoir placé un contrepoids approprié. </li><li> Retirer le tube à la fin du cycle. Remarquez le trois couches: plasma pauvre en plaquettes (PPP), la fibrine riche en plaquettes (L-PRF) et de la base RBC (Figure 1). </li><li> Aspirer le PPP à l&#39;aide d&#39;une pipette. L&#39;aide de pincettes tirez doucement sur le L-PRF et placez-le dans un maillage métallique perforée stérile. </li><li> Utilisation de scalpel, gratter la majeure partie de la couche de RBC laissant soigneusement le buffcouche intacte y. </li><li> Comprimer doucement le caillot L-PRF (en utilisant la plaque de métal stérile, poids approximatif 225 g) pendant 30 secondes. Plasma pauvre en plaquettes sera évincé. </li><li> Retirer la plaque et soulevez délicatement la membrane L-PRF. La membrane L-PRF est prêt pour une utilisation dans des expériences 12. </li></ol> 3. Uniaxial Essai de traction <ol><li> La place membranes L-PRF (n = 6) sur un papier filtre pour la facilité de manipulation et de punch en «os de chien&quot; en utilisant des matrices de métal sur-mesure (2,75 mm de large à son point le plus étroit avec une longueur de jauge de 7,5 mm). </li><li> Mesurer l&#39;épaisseur de chaque échantillon en trois points et prendre la moyenne. </li><li> Engager avec précaution la membrane L-PRF dans le centre des poignées de la mâchoire du système d&#39;essais uniaxiaux. </li><li> Détachez avec soin le support papier de filer pour exposer la membrane L-PRF. </li><li> Programme de l&#39;instrument de telle sorte que la tête mobile fonctionne à une vitesse constante (10,0 mm / min) et commencer l&#39;expérience lorsque le L-PRF est encore humide. </li><li> Enregistrez le module d&#39;élasticité, de l&#39;énergie à briser, et déformation à la rupture à partir du logiciel accompagnant le système de test uniaxial. Ces valeurs sont calculées automatiquement et aucune entrée définie par l&#39;utilisateur est requise. S&#39;il vous plaît voir la figure 3. </li></ol> 4. Suture force de rétention <ol><li> La place membranes L-PRF (n = 3) sur un papier filtre pour faciliter la manipulation et les couper en échantillons rectangulaires mesure (10 mm x 25 mm) à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Mesurer l&#39;épaisseur de chaque échantillon (moyenne de trois). </li><li> Ajouter un trou d&#39;épingle dans le centre de l&#39;échantillon en utilisant la ligature orthodontique fil en acier inoxydable (220 um de diamètre). </li><li> Passez le fil de ligature à travers le trou d&#39;épingle pour former une boucle et la fixer à la machine d&#39;essai de traction. Placer le bord de la membrane L-PRF à la poignée inférieure 13 de la mâchoire. </li><li> Programmer l&#39;instrument de telle sorte que la tête mobile fonctionne à une vitesse constante (10 mm / min) et le démarragel&#39;expérience. </li><li> Enregistrez le module d&#39;élasticité, de l&#39;énergie à briser, et déformation à la rupture à partir du logiciel accompagnant le système de test uniaxial. Ces valeurs sont calculées automatiquement et aucune entrée définie par l&#39;utilisateur est requise. S&#39;il vous plaît voir la figure 3. </li></ol> 5. Examen morphologique <ol><li> Préparer les échantillons L-PRF pour examen au MEB en utilisant un 10 mm cutanée biopsie punch et de les placer dans une plaque de 24 puits. </li><li> Laver les échantillons avec du PBS et fixer avec 2,5% de glutaraldéhyde (dans du PBS) pendant 20 min. </li><li> Déshydrater les échantillons par immersion dans l&#39;augmentation des concentrations d&#39;éthanol de façon séquentielle (50%, 70%, 80%, 90% et 100%) pendant 5 minutes chacun. </li><li> Traiter avec 0,5 ml de 100% de l&#39;hexaméthyldisilazane (HMDS) pendant 5 min. Aérer O / N pour éliminer l&#39;excès de HMDS 14. </li><li> Échantillons de montage sur les talons à l&#39;aide d&#39;un ruban adhésif double face, pulvérisation manteau platine pour 70 secondes et d&#39;examiner dans un microscope électronique à balayage fonctionnant à une accélérationtension de ration de 20 kV (ou le réglage approprié). </li></ol> 6. génipine réticulation de la L-PRF, la trypsine et la sensibilité Ninhydrine Assay <ol><li> Pour préparer génipine réticulé L-PRF, rincer les membranes avec du PBS et laisser tremper dans 4 ml de solution de génipine 1% (à 70% d&#39;éthanol) pendant 48 h. Rincer avec du PBS avant expériences pour enlever l&#39;excès génipine 15, 16. </li><li> Évaluer la stabilité de la réticulation de la génipine L-PRF par sa résistance à la dégradation par la trypsine. Lieu membrane L-PRF (n = 3) et la génipine réticulé L-PRF dans 500 ul de 0,01% de trypsine et on incube à 37 ° C pendant 3 jours avec un changement journalière de trypsine. <ol><li> Peser les échantillons au jour 1 avant enzyme exposition et au jour 3. La différence de début et de fin de poids représente la dégradation enzymatique 17. </li></ol></li><li> Quantifier la quantité de réticulation dans génipine traité L-PRF (G-PRF) par ninhydrine dosage. Préparer d&#39;abord la norme curve utilisant la glycine (mm 1 mm-0,031) courbe d&#39;établir la relation entre la concentration de l&#39;acide aminé libre (FAA) et l&#39;absorbance. <ol><li> PRF échantillons de chaleur avec 1 ml de 2% (p / v) de ninhydrine pour 15 minutes à 100 ° C. </li><li> Laisser la solution refroidir à température ambiante et ajouter 1,5 ml d&#39;éthanol à 50%. </li><li> Analyser l&#39;absorbance à 570 nm en utilisant un spectrophotomètre approprié. </li><li> Déterminer le pourcentage de réticulation en utilisant la formule ci-dessous 15 </li></ol></li></ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53221/53221eq1.jpg" /> 7. MTS prolifération cellulaire Assay <ol><li> Cultiver MC3T3 (préostéoblastes de la voûte crânienne de souris) dans de modification -alpha Minimum Essential Medium (aMEM) dans des flacons T-75 jusqu&#39;à ce qu&#39;une monocouche confluente de 80% est obtenu. </li><li> Préparer membrane L-PRF frais, stérile (ouvrir le tube L-PRF intérieur de la hotte de culture de cellules) et transférer la membrane sur une nouvelle boîte de culture cellulaire. </li><li> Support d&#39;Aspirer à partir de la fiole et rincer la monocouche avec du PBS, ajouter 5 ml de trypsine à 0,05% et placer le ballon dans la 37 o C incubateur pendant 5 min, une pipette le contenu du ballon dans un tube de centrifugation et centrifuger à 400 g pendant 5 min. </li><li> Décanter le surnageant, tapotez doucement le tube de briser le culot de cellules et remettre en suspension avec 4 ml d&#39;α MEM frais, distribuer un mélange de suspension de cellules (50 pi) et bleu trypan (50 pi) dans le hémocytomètre et compter le nombre de cellules </li><li> Graine 4x10 5 cellules à l&#39;intérieur 10 mm des anneaux de clonage en verre placés au-dessus des membranes L-PRF pour retenir les cellules dans les membranes (bagues peuvent être retirées après 24 h). </li><li> Au jour 4, rincer constructions avec PBS trois fois pendant 10 min. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu sans sérum et 200 ul réactif MTS pour chaque puits et incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance de 200 aliquotes à 490 nm. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+fibrin+(PRF):+a+second-generation+platelet+concentrate.+Part+I:+technological+concepts+and+evolution.">Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part I: technological concepts and evolution.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).</li><li>Dohan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+fibrin+(PRF):+a+second-generation+platelet+concentrate.+Part+II:+platelet-related+biologic+features.">Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part II: platelet-related biologic features.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e45-e50 (2006).</li><li>Choukroun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+fibrin+(PRF):+a+second-generation+platelet+concentrate.+Part+V:+histologic+evaluations+of+PRF+effects+on+bone+allograft+maturation+in+sinus+lift.">Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part V: histologic evaluations of PRF effects on bone allograft maturation in sinus lift.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), 299-303 (2006).</li><li>Dohan Ehrenfest, D. M., Bielecki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+the+Fibrin+Architecture+and+Leukocyte+Content+Influence+the+Growth+Factor+Release+of+Platelet+Concentrates?+An+Evidence-based+Answer+Comparing+a+Pure+Platelet-Rich+Plasma+(P-PRP)+Gel+and+a+Leukocyte-+and+Platelet-Rich+Fibrin+(L-PRF).">Do the Fibrin Architecture and Leukocyte Content Influence the Growth Factor Release of Platelet Concentrates? An Evidence-based Answer Comparing a Pure Platelet-Rich Plasma (P-PRP) Gel and a Leukocyte- and Platelet-Rich Fibrin (L-PRF).</a> Curr Pharma Biotechno. 13 (7), 1145-1152 (2012).</li><li>Dohan Ehrenfest, D. 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Les auteurs ont rien à divulguer et confirment qu&#39;il n&#39;y a pas de conflits d&#39;intérêts connus associés à cette publication.

Concentrés plaquettaires autologues sont prometteurs dans le domaine de la médecine régénérative 18 en raison de l&#39;abondance de facteurs de croissance. Cependant, ces préparations manquaient souvent une structure définie qui rend la manipulation chirurgicale très difficile. Plusieurs fois, les suspensions et les gels ne sont pas conservées efficacement au niveau du site de livraison, ce qui entraîne des résultats imprévisibles. L-PRF représente un énorme progrès dans l&#39;évolution de con...

The use of blood and blood-derived products to seal wounds and improve healing in different clinical situations started with fibrin glues, which are mainly fibrinogen concentrates. Addition of platelets to fibrin glue not only improved their strength but also promoted neoangiogenesis and regeneration. These benefits are attributed to the release of a variety of peptide growth factors from the alpha-granules of platelets upon activation1. Platelet concentrates (PC) were seen as a practical way to deliver growth factors2 and its use was driven by commercial interests rather than research characterization3. In fact, PCs are difficult to characterize unlike homogenous and defined pharmacological preparations, they are a potpourri of signaling molecules and blood cells (platelet and leukocytes) entrapped within a fibrin matrix. Different commercial and proprietary preparations yield a variety of PC that are different in cellular composition, growth factor recovery and kinetics of release4. 
It is important to realize that in most oral surgeries, platelet-rich plasma (PRP) preparations are used as a gel in open surgical wounds and not as platelet suspensions. In these situations, the gelation is induced by the addition of thrombin, calcium chloride, batroxobin or other agents and directly placed in the site of injury5. Due to rapid activation, fibrinogen polymerization is often incomplete and results in friable fibrin gels with very little mechanical strength. In addition, injectable PRP gels undergo rapid fibrinolysis6,7.
In contrast, the processes of blood coagulation (fibrinogen polymerization), platelet enrichment and activation occur simultaneously in the preparation of L-PRF8. The coagulation cascade is triggered when whole blood contacts the walls of a dry glass tube and continues throughout the centrifugation process. This results in the formation of a mechanically-strong blood clot (L-PRF) that can be surgically handled and used. 
Even though L-PRF has been investigated in terms of optimal methods of preparation, growth factor release and cell distribution9-11, detailed mechanical characterization of these membranes are lacking. This is significant gap in knowledge, given the popularity of these membranes in clinical practice as well as its potential to be used as a biomaterial. Current study focusses on the protocol for deriving L-PRF as well as methods that can be employed to study its mechanical properties. This data is intended to serve as baseline for ongoing studies investigating the viscoelastic properties of this interesting natural biomaterial.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Needle 19G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Disposal Container</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red-Topped Glass Collection Tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>8020129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Pads</td>
			<td>Tyco</td>
			<td>5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandage</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>5005989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surshield</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV*S19BL</td>
			<td>Safety winged infusion set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Collection Assembly</td>
			<td>BD</td>
			<td>303380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tourniquets</td>
			<td>BD</td>
			<td>367203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brand Luer Adapter</td>
			<td>Vacutainer</td>
			<td>L42179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intra-Spin System&#160;</td>
			<td>Intra-Lock International</td>
			<td>ISS110</td>
			<td>Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (Serological &#38; Micro)</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Exelint</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Bionix 200</td>
			<td>MTS Systems Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Material testing systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Test Works 4</td>
			<td>MTS Systems Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Orthodontic ligature wire</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>628-4228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Mounting Stubs</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Carbon Tape</td>
			<td>PELCO Tabs</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>LV 5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimicotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genipin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>078-03021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12000-022</td>
			<td>Minimum Essential Medium-Alpha</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G1118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMS Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Glass Cloning Rings</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3166-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>55-031-PB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ninhydrin 98%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>454044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>Acu Punch</td>
			<td>P1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrometer</td>
			<td>Pittsburgh</td>
			<td>68305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of leukocyte-platelet rich fibrin, a novel biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral surgery. Unlike platelet rich plasma (PRP) that is a gel or a suspension, Leukocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) is a solid 3D fibrin membrane generated chair-side from whole blood containing no anti-coagulant. The membrane has a dense three dimensional fibrin matrix with enriched platelets and abundant growth factors. L-PRF is a popular adjunct in surgeries because of its superior handling characteristics as well as its suturability to the wound bed. The goal of the study is to demonstrate generation as well as provide detailed characterization of relevant properties of L-PRF that underlie its clinical success.

L&#39;image de microscopie électronique à balayage du caillot L-PRF à différentes sections (haut, milieu et bas) couche est illustrée à la figure 2. Comme on le voit, la partie supérieure est composé majoritairement de réseau de fibrine sans cellules. La couche du milieu est enrichi en plaquettes avec la preuve de leur activation et la dégranulation. La couche inférieure a un mélange de leucocytes et les globules rouges piégées dans une matrice de fibrine. <p class="jo...

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Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) represents an FDA cleared preparation of autologous platelet concentrates that possesses unique fibrin architecture, enriched platelets and abundant growth factors. Here, we present a protocol for chair-side generation of L-PRF as well as evaluate its mechanical properties including uniaxial testing and suture retention strength testing.

Caractérisation de leuco-plaquettaire Rich fibrine, un roman biomatériaux

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K vues.  School of Dentistry, Virginia Commonwealth University. Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) represents an FDA cleared preparation of autologous platelet concentrates that possesses unique fibrin architecture, enriched platelets and abundant growth factors. Here, we present a protocol for chair-side generation of L-PRF as well as evaluate its mechanical properties including uniaxial testing and suture retention strength testing. 