Les auteurs tiennent à remercier le Dr Isaac Zambrano et le personnel de la Manchester Eye Hospital Banque d&#39;yeux pour la fourniture de tissus de l&#39;œil de donneur humain, et M. Pete Walker, de la Faculté de l&#39;établissement Life Sciences histologie pour les images H &amp; E colorées. Un merci tout spécial à M. Roger Meadows pour son aide avec la microscopie. SJC est récipiendaire d&#39;un Conseil de recherches médicales du développement (MRC) Carrière Fellowship (MR / K024418 / 1) et les auteurs reconnaissent aussi d&#39;autres financement récent de recherche du CRM (G0900538 et K004441), Fight for Sight (1866) et La Société maculaire.

Tissus de l&#39;œil humain consenti à des fins de recherche a été obtenu à partir de la Manchester Royal Eye Hospital Eye Bank après l&#39;enlèvement de la cornée pour la transplantation. L&#39;utilisation de tissus humains pour la recherche était en conformité avec la Loi sur les tissus humains (2004) des lignes directrices, et avec l&#39;approbation Comité d&#39;éthique de la recherche universitaire (référence 11305). 1. Enrichissement de la membrane de Bruch entier <ol><li> Nettoyez l&#39;espace de travail autour et sous le microscope de dissection avec 1% de désinfectant (v / v), puis essuyez avec 70% (v / v) d&#39;éthanol. </li><li> Vérifiez les points suivants sont à portée de main: un nouveau scalpel jetable, deux grattoirs stériles cellulaires (couramment utilisés dans la culture de tissus) et trois paires de pinces (énumérés ici comme A, B, et C, voir la liste des matériaux). </li><li> Placez le globe oculaire dans une boîte de Petri à usage unique, en conservant le couvercle pour une utilisation ultérieure. Grâce à un nouveau scalpel jetable, retirer tout nerf optique résiduelle, ce qui peut interférer avec la création d&#39;une plate mount du tissu. Ensuite, assurez-quatre incisions également espacées pour créer quatre quadrants, si de passer à la partie 3 (enrichissement de la membrane de Bruch maculaire) ne pas couper à travers la région de la macula. <ol><li> Assurez-vous que les entailles traversent toute la profondeur du tissu oculaire - à partir de la rétine neurosensorielle plus à l&#39;intérieur (NSR), à travers la choroïde et la sclérotique (blanc de l&#39;oeil). Continuer l&#39;incision tout le chemin autour de l&#39;œil de la marge de l&#39;œilleton vers le nerf optique. Cela permettra à l&#39;œilleton d&#39;être aplati (voir la figure 1B). </li></ol></li><li> Tenir un quadrant de œilleton aplati en utilisant pince A (pour empêcher le détachement de la choroïde), utiliser la plus grande pince B pour saisir le NSR vitré et sous-jacente et tirez ce tissu loin de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de la périphérie, se déplaçant vers le centre de l&#39;œilleton ouvert et ensuite à la partie adverse. Habituellement, mais pas toujours à la fois vitreux et détacher comme une NSR. Utilisez le scalpel à exciser toute NSR résiduelle ancré à la papille. </li><li> Encore une fois, tout en maintenant un quadrant de tissu en place en utilisant pince A, utiliser le grattoir cellulaire stérile pour déloger doucement la monocouche RPE de la totalité de la surface interne de l&#39;œilleton. Ces cellules se détachent facilement et peuvent être vus touffes brun-pigmentées sombres. Rincer avec du PBS pour laver en douceur les cellules RPE loin délogés de l&#39;œilleton. </li><li> Ensuite, utilisez pince A à retirez délicatement le tissu rouge foncé recouvrant (comprenant à la fois la membrane de Bruch et la choroïde) de tous les 4 quadrants de l&#39;oeil. Placez le tissu excisé dans un plat propre. </li><li> En utilisant le bord aplati d&#39;un gratteur de cellules pour maintenir le tissu excisé en place, utilisez le second grattoir pour gratter délicatement le tissu. Tournez le tissu et répéter, en supprimant autant excès de matériau que possible. Finalement, une membrane translucide restera: ceci est la membrane de Bruch grossièrement enrichi. L&#39;utilisation du microscope de dissection à un minimum de grossissement 20X estessentiel en facilitant l&#39;élimination de la choroïde et de l&#39;enrichissement de la membrane de Bruch. </li><li> Avec une pipette Pasteur, rincer rapidement la membrane de Bruch avec de l&#39;eau ultra pure pour enlever la choroïde résiduelle et de sang avant de placer la membrane dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Suspendre la membrane de Bruch enrichi dans environ 1 ml d&#39;eau ultra pure et brièvement de vortex (environ 15 secondes) pour aider à la lyse cellulaire contaminer toute question (voir la figure 2). Centrifuger l&#39;échantillon à 500 g pendant 30 secondes pour sédimenter la membrane et aspirer le surnageant. Remarque: la membrane de Bruch Le reste enrichi est maintenant prêt pour la solubilisation (comme décrit au paragraphe 2 ci-dessous) ou de stockage à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 2. solubilisation de la membrane et Western Blot Analyse de l&#39;entier enrichi Bruch <ol><li> D&#39;extrait de protéines de la membrane de Bruch enrichi en plongeant le tissu dans 500 pi 8 M urEA pendant 6 heures à la température ambiante dans 1,5 ml microtubes (figure 3A). </li><li> Centrifuger les échantillons solubilisés à 10 000 xg pendant 10 min pour sédimenter toute matière restante extracellulaire. Retirer le surnageant et le transférer à 3.500 membrane de dialyse MWCO Da, puis placez l&#39;échantillon dans 1 L de PBS pour dialyse pendant 16 heures à 4 ° C. </li><li> Pour chaque échantillon, ajouter 40 ul de billes d&#39;isolement des protéines, et faire tourner l&#39;échantillon / mélange bourrelet (20 tpm sur un agitateur rotatif) à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 10 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les billes. Retirer le surnageant et solubiliser la protéine liée à des billes dans 30 pi de 2 x tampon de charge d&#39;échantillon (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (p / v) de glycerol, 0,01% de bleu de bromophénol, 3% β-mercaptoethanol). </li><li> Incuber les échantillons à 100 ° C pendant 10 minutes, puis centrifuger à 10 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les billes restantes. </li><li> Chargez le surnageant qui contient les protéines libérées à un pré-casting SDSgel page gradient (voir la liste des matériaux) pour la séparation des protéines. </li><li> Visualiser les bandes de protéine séparée en utilisant un protocole de coloration commune, par exemple, le bleu de Coomassie. <ol><li> En bref, ajouter 20 ml de la tache bleu brillant (0,1% de bleu brillant (p / v), 50% de méthanol, 10% d&#39;acide acétique glacial, 40% d&#39;eau) sur le gel, et incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation douce . </li><li> Jeter la solution de coloration et laver le gel coloré avec de l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à ce que la coloration de fond est suffisamment réduite pour permettre à la protéine teinté bande visualisation. </li><li> En variante, le transfert séparé des bandes de protéines sur de la nitrocellulose pour analyse western, comme décrit ci-dessous. </li></ol></li><li> Transfert séparé bandes de protéines sur une membrane de nitrocellulose à 80 mA pendant 2,5 heures en utilisant un appareil de transfert semi-sec dans un tampon de transfert (25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 10% [v / v] méthanol). </li><li> Bloquer la membrane dans 10 ml de PBS, 10% (p / v) de lait, et 0,02% (p / v) de BSA pendant 16 heures à 4 ° C avant the addition des anticorps primaires souhaitées pour la détection de protéine. Remarque: Par exemple ici, la figure 3C montre un immunotransfert représentatif de la membrane de Bruch solubilisation de trois donneurs distincts sondé pour un régulateur de la cascade du complément, le facteur H-like protein 1 (FHL-1). </li></ol> 3. Enrichissement de la membrane de Bruch maculaire <ol><li> Suivre les étapes 1,1 - 1,3, comme décrit précédemment. </li><li> Alors que le NSR est toujours en place, localiser la fovéa coloration jaune qui représente la région de la macula centrale (voir Figure 4). Utilisation d&#39;un 6 mm biopsie poinçon stérile, placer au-dessus de la région de la fovéa et couper fermement dans la macula. <ol><li> Garder le poinçon de biopsie en place, faire une incision séparée avec un scalpel à partir du bord de l&#39;œilleton vers le bord de la lame biopsie punch, puis en utilisant pince B, décoller la matière environnante oeil à réaliser une biopsie propre. </li></ol></li><li> Utilisation pince C, supprimerle disque de 6 mm de tissu du poinçon et le placer sur le couvercle de la boîte de Pétri propre. Placez le couvercle de boîte de Pétri et de punch maculaire sous le microscope de dissection. </li><li> Retirez le disque NSR mince (vérifier jaune fovéale coloration de déduire exactitude de biopsie). Utilisez un grattoir à cellules stérile pour enlever délicatement les cellules de l&#39;EPR. </li><li> Fixez le disque maculaire via la sclérotique en utilisant les conseils de pince A, et pelez lentement la choroïde et le complexe de la membrane de Bruch utilisant pince C. Encore une fois, utiliser le grattoir de cellules pour enlever la choroïde indésirables et de la matière de sang de la membrane de Bruch. </li><li> Placez la membrane de Bruch maculaire dans un tube de 1,5 ml et de suspendre dans 1 ml d&#39;eau ultra-pure. Vortex brièvement (environ 15 secondes) pour aider à la lyse cellulaire contaminer toute question. Centrifuger l&#39;échantillon à 500 g pendant 30 secondes pour sédimenter la membrane et aspirer le surnageant. Note: La membrane de Bruch enrichi isolé de la macula peut maintenant être utilisé pour un protéomiquealy en utilisant des protocoles de digestion préférées de l&#39;utilisateur. </li></ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li><li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li><li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+Bruch&#8217;s+membrane.">The dynamic nature of Bruch&#8217;s membrane.</a> Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).</li><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factor+H-like+protein+1+as+the+predominant+complement+regulator+in+Bruch&#8217;s+membrane:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch&#8217;s membrane: implications for age-related macular degeneration.</a> J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).</li><li>Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+(beta+1+H).">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li><li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H.">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li><li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch&#8217;s+membrane.">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch&#8217;s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Nous décrivons ici l&#39;enrichissement de la membrane de Bruch pour une analyse approfondie permettant des analyses ultérieures, y compris western blot 11, spectrométrie de masse et les propriétés de diffusion de la membrane de Bruch utilisant modifiée chambres 11,14 Ussing. Les étapes critiques comprennent a) le raclage approfondie et lavage de la surface interne de l&#39;œil pour éliminer toutes les cellules RPE b) le raclage répété et attentive de la choroïde sous-jacente sans provoquer de Bruch se désintégrer et c) le lavage de la Bruch excisé de l&#39;eau ultrapure pour assurer la lyse des cellules résiduelles. En outre, si la membrane de Bruch la enrichie doit être utilisé pour l&#39;analyse protéomique, l&#39;extraction de la protéine par traitement à l&#39;urée est la plus efficace dans la dégradation du tissu élastique présente par rapport aux autres méthodes telles que l&#39;homogénéisation mécanique. L&#39;histologie de la membrane de Bruch enrichi indique l&#39;ECM de la choriocapillaire est pas supprimé. Ce doit être exinatten- que la couche externe de la membrane de Bruch la pentilaminar est formé par choriocapillaire endotheliales membranes basales des cellules. En effet, il peut être avantageux que l&#39;ECM de la choriocapillaire reste que des changements se produisent dans la présente dans la DMLA, y compris le dépôt de complexe complexe / d&#39;attaque membranaire du complément terminal (MAC) 15. Il convient de noter que pour l&#39;analyse histologique détaillé de la membrane de Bruch, la structure serait mieux préservé si coupe en présence de la sclérotique, la choroïde et la membrane de Bruch. En effet, l&#39;histologie présenté dans la figure 2 est uniquement destiné à démontrer le degré d&#39;enrichissement résultant de la technique décrite dans ce manuscrit. Enrichissement de maculaire Bruch nécessite dissection minutieuse de l&#39;œilleton, assurant que le NSR et en particulier la fovéa ne sont pas endommagés; autrement identification et ainsi l&#39;isolement de la macula ne sont pas possibles. L&#39;intégrité du tissue est également important de ce processus et il est donc recommandé que les échantillons de moins de 48 heures de temps post-mortem être utilisés. Le degré d&#39;enrichissement requis varie entre les donateurs et peut être affectée par l&#39;âge du donneur, le temps post-mortem, et la présence de toute pathologie oculaire. L&#39;utilisation du terme enrichi est délibérée dans la reconnaissance d&#39;une limitation de la technique, ce qui est que «la purification» ou «isolement» de la membrane de Bruch en utilisant cette méthode est tout simplement pas possible. En effet, étant donné que l&#39;ECM de la choriocapillaire fusionne dans la membrane de Bruch séparation complète il est impossible. Comprendre les changements biochimiques des tissus oculaires respectifs est essentiel dans la compréhension de la progression de la maladie de l&#39;œil. Cet enrichissement unique de la membrane de Bruch facilite cette compréhension; études en cours étudient le protéome du maculaire enrichi membrane de Bruch en utilisant la spectrométrie de masse à différents stades de la DMLAet dans des échantillons provenant de sujets avec différents génotypes d&#39;améliorer la compréhension de la pathologie moléculaire de la DMLA. Déjà la technique décrite ici a été utilisé pour identifier avec succès FHL-1 en tant que régulateur du complément prédominant dans la membrane 11 et d&#39;autres études de Bruch sur la membrane de enrichi Bruch sont susceptibles d&#39;aboutir à de nouvelles idées plus dans la pathologie moléculaire de la DMLA.

L&#39;utilisation de tissus de l&#39;œil humain post-mortem dans la recherche ophtalmique est une ressource inestimable pour la compréhension de la pathogenèse de la maladie de l&#39;œil. Analyse des yeux des bailleurs de fonds humaines a fait d&#39;importantes contributions à discerner les mécanismes qui sous-tendent liée à l&#39;âge dégénérescence maculaire (AMD), qui est la principale cause de cécité dans le monde occidental 1. Globalement, AMD représente environ 8,7% des cas de cécité et d&#39;une population vieillissante de plus en plus, il est prévu d&#39;affecter 196 millions de personnes par les résultats 2020 2. AMD dans la perte de la vision centrale et a un impact profond sur l&#39;indépendance et la qualité de vie des patients 3. DMLA précoce est caractérisée par la formation de druses et il peut évoluer vers une atrophie géographique (parfois dénommé «sec» AMD), ou néovascularisation choroïdienne (également dénommé néovasculaire ou «humide» AMD). Alors anti-VEGF injections peuvent stabiliser ou améliorer la vision de la DMLA néovasculaire il iest pas curative, et à l&#39;heure actuelle, aucun traitement existe pour l&#39;atrophie géographique. Alors il a été démontré certaines variantes génétiques de modifier AMD risque de 4 - 8, on en sait moins sur la façon dont ces variantes affectent la macula à un niveau biochimique. Un site important dans la pathogenèse AMD est la membrane de Bruch. Forme DRUSEN sein de cette structure et diverses études ont fourni des preuves de l&#39;activation du complément dans et autour de la membrane de Bruch dans AMD 9. La membrane de Bruch est une feuille de la matrice extracellulaire qui sépare les cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (RPE) de la choroïde, et est d&#39;environ 4 pm d&#39;épaisseur. La membrane de Bruch fusionne dans la choriocapillaire, une couche de la choroïde qui contient capillaires fenêtrés et externe à ce sont des couches contenant de plus grands vaisseaux sanguins 10 (figure 1A). La membrane de Bruch est une feuille supplémentaire de pentilaminarmatrice cellulaire (ECM), et cette méthodologie détails comment isoler la membrane de Bruch, avec l&#39;ECM de la choriocapillaire sous-jacents (ci-après appelé enrichi la membrane de Bruch), qui est en grande partie décellularisé et exempt de globules rouges. La membrane de Bruch enrichi a ensuite été utilisé pour des expériences de buvards et d&#39;histologie de l&#39;Ouest. En outre, la méthodologie pour enrichir la membrane de Bruch uniquement à partir de la région de la macula de l&#39;œil est décrite, qui sera d&#39;un intérêt particulier pour ceux qui enquêtent sur les aspects biochimiques de la DMLA.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

La dégénérescence maculaire (AMD) liée à l&#39;âge est la principale cause de déficience visuelle dans le monde développé. La maladie se manifeste par la destruction du centre de la rétine, appelée la macula, ce qui entraîne la perte de la vision centrale. DMLA précoce est caractérisé par la présence de petites lésions jaunâtres appelés drusen mous qui peut évoluer sur la fin AMD tels que l&#39;atrophie géographique (DMLA sèche) ou la néovascularisation (DMLA humide). Bien que les changements cliniques sont bien décrits, et la compréhension des influences génétiques sur conférant le risque de DMLA sont de plus en plus détaillée, une zone dépourvue progrès majeur est de comprendre les conséquences biochimiques de risque génétique. Ceci est partiellement dû à des difficultés dans la compréhension de la biochimie de la membrane de Bruch, une matrice extracellulaire très mince qui agit comme un filtre biologique de la matière à partir de l&#39;approvisionnement en sang et un échafaudage sur lequel l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (RPE) monocouche cellulaire réside. Drusen form à l&#39;intérieur de la membrane de Bruch et leur présence perturbe l&#39;écoulement des éléments nutritifs pour les cellules RPE. Seulement en enquêtant sur la composition en protéines de la membrane de Bruch, et même la façon dont d&#39;autres protéines interagissent avec elle, les chercheurs peuvent espérer démêler les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la formation de druses, développement de la DMLA et après la perte de vision. Cet article détaille les méthodes pour enrichir soit membrane de Bruch ensemble, ou tout simplement de la région de la macula, de sorte qu&#39;il peut être utilisé pour l&#39;analyse biochimique aval, et de fournir des exemples de la façon dont cela est déjà en train de changer la compréhension de la membrane de Bruch la biochimie.

Le protocole décrit ci-dessus pour produire les résultats de la enrichie membrane de Bruch dans l&#39;isolement de la membrane de Bruch, la MEC de la choriocapillaire et supprime la plupart des cellules / débris cellulaires, y compris la totalité de la RPE (figure 2). Le lavage de la membrane de Bruch enrichi dans de l&#39;eau est une étape clé dans la lyse des cellules de la choroïde restants. La pression exercée au cours de la mise au rebut de la choroïde apparaît pour compacter une partie de ces noyaux de cellules restantes dans la région définie par la membrane de Bruch (figure 2B). La solubilisation de la membrane de Bruch enrichi permet l&#39;analyse en aval de sa teneur en protéines. La séparation des bandes de protéines à partir de solubilisés enrichi la membrane de Bruch en utilisant un 4 - gel à gradient de SDS-PAGE à 12%, tandis que pas utile en soi pour identifier la teneur en protéine, le fait de démontrer la capacité de cette technique pour minimiser les protéines contaminantes dans le sang ce que Are lié de manière non spécifique (figure 3B). À cet égard, un grand absent de la course de gel de protéine est un groupe non négligeable de l&#39;albumine sérique humaine (~ 66 kDa) qui peuvent rendre autrement ultérieures Western blot plus difficile à interpréter: l&#39;analyse histologique de la membrane de enrichi Bruch figure 2 montre également des supports ce. En effet, dans le cadre de travail décrit précédemment 11, solubilisation de la membrane de Bruch à partir d&#39;une série de donateurs individuels ont été sondés pour un certain nombre de protéines en utilisant des anticorps spécifiques par Western blot (figure 3C). Dans le cas représenté ici, un anticorps (appelé OX23) 12 dirigé contre un 155 kDa régulateur de l&#39;immunité innée, appelé facteur H du complément (FH), a été utilisé et a démontré la présence d&#39;une bande de plus bas poids moléculaire dans les échantillons de membrane de Bruch de trois séparé les bailleurs de fonds (figure 3C). Cette suite avéré être le facteur H-like protein 1 (FHL-1), Une protéine de 49 kDa liée à FH et résultant d&#39;une variation d&#39;épissage du même gène 13. FHL-1 semble être le principal régulateur du complément présent dans la membrane de Bruch 11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Figure 1. Dissection de l&#39;oeil humain et l&#39;enrichissement des membrane de Bruch. (A) la membrane de Bruch est une barrière de la matrice extracellulaire. La choroïde contient une couche de capillaires fenêtrés qui se fondent en continu dans la membrane de Bruch (appelée la choriocapillaire) et celles-ci sépare le reste de la choroïde (contenant les gros vaisseaux sanguins) à partir de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de la monocouche cellulaire, qui prend en charge physiologiquement les cellules photoréceptrices de la rétine neurosensorielle (NSR). (B) Quatre incisions dans l&#39;œilleton humains sont faits lui permettant d&#39;être ouvert pour créer un support plat. Lavitreux peut être enlevé à l&#39;aide d&#39;une pince à épiler. Le NSR peut se détacher avec le corps vitré, mais peut aussi être retiré avec des pincettes. Un racleur de cellules est utilisé pour enlever la couche de cellules RPE de la membrane de Bruch alors qu&#39;il est encore ancré à la choroïde et la sclère. Le complexe membrane / choroïde au Bruch peut être décollée de la sclérotique et à utiliser un nouveau racleur de cellules, la choroïde extérieur peut être enlevé. Un lavage final dans de l&#39;eau ultra pure lyse cellulaire toute question restante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;histologie de la membrane de Bruch et les sections choroïde. H &amp; E tachée avant (A) et après (B) raclant les structures de la choroïde extérieures de la membrane de Bruch et de lavage dans wa ultrapurster pour générer enrichi la membrane de Bruch. Les barres d&#39;échelle représentent 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Figure 3. La solubilisation de la membrane de Bruch enrichi pour l&#39;analyse de la protéine de contenu. (A) La protéine peut être extraite de la membrane de Bruch enrichi par incubation dans de l&#39;urée 8 M pendant 6 heures à la température ambiante, avant d&#39;être dialysé contre du PBS. Pour l&#39;analyse de l&#39;Ouest, les protéines de la membrane entière dialysat de Bruch peuvent être isolés en utilisant des perles d&#39;isolement de protéines et élues par l&#39;ébullition avec Laemmli tampon réducteur de chargement d&#39;échantillon. (B) Un représentant du bleu de Coomassie gel coloré SDS-PAGE, montrant à la fois soignée et dilué solubiliser la membrane de Bruch (BM) en utilisant le procédé d. escribed dans (A) (C) un Western blot représentatif de la membrane de Bruch solubilisé à partir de 3 donateurs individuels (voies 1 - 3). sondé pour le facteur H-like protein 1 (FHL-1) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figure 4. Isolement de la membrane de Bruch Enrichi de la macula. La région macula de la rétine est une zone de 5 mm qui peut être facilement identifié par la coloration jaune de la fovéa sus-jacente, et sa proximité de la papille adjacente. Utilisation de la fovéa comme guide, placez une biopsie poinçon 6 mm sur l&#39;œil humain monté à plat pour exciser un bloc de tissu macula 6 mm. Retirez le NSR de recouvrement et gratter cellules RPE de la macula excisée. Le complexe membrane / choroïde de Bruch restant peut len être décollée de la sclérotique et soigneusement gratterez choroïde, Lyse restant matériau cellulaire par immersion dans l&#39;eau ultra-pure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Enrichment of Bruch&#039;s Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Enrichissement de la membrane de Bruch des yeux de donneur humain

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

11.9K vues.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

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Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

L&#39;isolement, l&#39;enrichissement et l&#39;entretien des cellules souches Médulloblastome

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Recherche

Neurosciences

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Dérivation des cultures leptoméninge explants de Postmortem humaines donateurs cerveau

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Élaboration d’un protocole raffiné pour Trans-sclérale Transplantation sous-rétinienne des cellules épithéliales humaines pigmentaire dans les yeux de Rat

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular pressure (IOP) which&#160;can identify various pathogenic paradigms related to the glaucoma pathogenesis. Ex vivo human anterior segment perfusion organ culture models have previously been successfully utilized and applied as effective technologies for the discovery of glaucoma pathogenesis and testing of therapeutics. Preclinical drug screening and research performed on ex vivo human organ systems can be more translatable to clinical research. This article describes in detail the generation and operation of a novel ex vivo human translaminar pressure model called the translaminar autonomous system (TAS). The TAS model can independently regulate ICP and IOP using human donor posterior segments. The model allows for studying pathogenesis in a preclinical manner. It can reduce the use of living animals in ophthalmic research. In contrast to in vitro experimental models, optic nerve head (ONH) tissue structure, complexity, and integrity can also be maintained within the ex vivo TAS model.

We describe and detail the use of the translaminar autonomous system. This system utilizes the human posterior segment to independently regulate the pressure inside the segment (intraocular) and surrounding the optic nerve (intracranial) to generate a translaminar pressure gradient that mimics features of glaucomatous optic neuropathy.

Modèle de système autonome translaminaire pour la modulation de la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs des donneurs humains

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Imagerie multimodale basée sur l’OCT de l’œil d’un donneur humain pour la recherche sur la DMLA

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging could add prognostic value to laboratory findings. In this work, ex vivo OCT and MMI were applied to human donor eyes prior to retinal tissue sectioning. The eyes were recovered from non-diabetic white donors aged &#8805;80 years old, with a death-to-preservation time (DtoP) of &#8804;6 h. The globes were recovered on-site, scored with an 18 mm trephine to facilitate cornea removal, and immersed in buffered 4% paraformaldehyde. Color fundus images were acquired after anterior segment removal with a dissecting scope and an SLR camera using trans-, epi-, and flash illumination at three magnifications. The globes were placed in a buffer within a custom-designed chamber with a 60 diopter lens. They were imaged with spectral domain OCT (30&#176; macula cube, 30 &#181;m spacing, averaging = 25), near-infrared reflectance, 488 nm autofluorescence, and 787 nm autofluorescence. The AMD eyes showed a change in the retinal pigment epithelium (RPE), with drusen or subretinal drusenoid deposits (SDDs), with or without neovascularization, and without evidence of other causes. Between June 2016 and September 2017, 94 right eyes and 90 left eyes were recovered (DtoP: 3.9 &plusmn; 1.0 h). Of the 184 eyes, 40.2% had AMD, including early intermediate (22.8%), atrophic (7.6%), and neovascular (9.8%) AMD, and 39.7% had unremarkable maculas. Drusen, SDDs, hyper-reflective foci, atrophy, and fibrovascular scars were identified using OCT. Artifacts included tissue opacification, detachments (bacillary, retinal, RPE, choroidal), foveal cystic change, an undulating RPE, and mechanical damage. To guide the cryo-sectioning, OCT volumes were used to find the fovea and optic nerve head landmarks and specific pathologies. The ex vivo volumes were registered with the in vivo volumes by selecting the reference function for eye tracking. The ex vivo visibility of the pathology seen in vivo depends on the preservation quality. Within 16 months, 75 rapid DtoP donor eyes at all stages of AMD were recovered and staged using clinical MMI methods.

Pleins feux sur l’auteur : Imagerie multimodale ex vivo basée sur l’OCT d’yeux de donneurs humains pour la recherche sur la dégénérescence maculaire liée à l’âge  

Laboratory assays can leverage prognostic value from the longitudinal optical coherence tomography (OCT)-based multimodal imaging of age-related macular degeneration (AMD). Human donor eyes with and without AMD are imaged using OCT, color, near-infrared reflectance scanning laser ophthalmoscopy, and autofluorescence at two excitation wavelengths prior to tissue sectioning.

Ex Vivo Imagerie multimodale basée sur l’OCT des yeux de donneurs humains pour la recherche sur la dégénérescence maculaire liée à l’âge

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...