Nous remercions Daniel Veit pour l&#39;assistance technique et Pedro Gouveia à Electricidade Em Po (electricidadeempo.net) pour personnaliser le logiciel de suivi de nos demandes. Nous remercions aussi Tom Retzke de soutien pendant le processus de tournage. Cette étude a été soutenue par la Société Max Planck.

La construction et les détails techniques de Flywalk ont été décrites ailleurs 26 (en cas de problèmes d&#39;établir cette mise en place, de plus amples informations peuvent être obtenues à partir de MK). Ici nous nous concentrons sur des instructions détaillées sur la manipulation du paradigme qui aidera à obtenir des résultats fiables. 1. Fly Manutention <ol><li> Arrière vole en bas de cultures moyennes de densité sur un milieu alimentaire en vertu d&#39;un 27 h 12: légères 12 h: régime sombre à 23-25 ​​° C et 70% d&#39;humidité relative. À cette fin, permettre 20-30 adultes nouvellement émergé vole à reproduire dans un grand flacon alimentaire pendant 1 semaine, puis jetez-mouches adultes et attendre progéniture à émerger. </li><li> Recueillir 30-40 nouvellement écloses (âge &lt;24 h) les mouches adultes et de leur âge sur la nouvelle dans un flacon contenant le milieu de la nourriture 27 pendant 3-5 jours. </li><li> Vingt-quatre heures avant le début de l&#39;expérience comportementale: Transférer la totalité 30-40 recueillis antérieurement 3-5 d vieille (voir 2.2) vole vers un nouveau vial contenant un bouchon en mousse de caoutchouc humide ou un mouchoir en papier humide à l&#39;aide d&#39;un aspirateur. REMARQUE: Ne pas anesthésier les mouches utilisant le CO 2. </li></ol> 2. Préparation de la configuration Flywalk <ol><li> Utilisez bouteilles de 250 ml que les humidificateurs. Remplissez humidificateurs avec 100 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Préparer flacons d&#39;odeurs. <ol><li> Préparer 10 -3 500 ul des dilutions de l&#39;acétate d&#39;éthyle pur odeurs, le butyrate d&#39;éthyle, l&#39;acétate d&#39;isopentyle et de 2,3-butanedione dans le solvant de l&#39;huile minérale. </li><li> Fixez les deux clapets anti-retour de la balle par l&#39;odeur du flacon. Notez que l&#39;enregistrement vannes permettent une circulation d&#39;air unidirectionnelle seulement. Par conséquent, la connexion clapets anti-retour de telle sorte que l&#39;air puisse entrer dans le flacon d&#39;un côté et le laisser sur l&#39;autre côté. </li><li> Retirer le couvercle d&#39;un tube de réaction PCR de 200 pi. Pipeter 100 ul de chaque dilution des odeurs dans un tube de réaction séparé et placer les tubes dans des flacons d&#39;odeurs distinctes. Aussi préparer un flacon d&#39;odeur ne contenant que le solvant oi minéralel. </li><li> Bien sceller les flacons d&#39;odeurs en les fermant à l&#39;aide des bouchons en acier inoxydable et joints en caoutchouc. </li><li> Connecter les 5 flacons d&#39;odeurs (4 odeurs contenant et 1 contenant de l&#39;huile minérale) au système de livraison de l&#39;odeur. Assurez-vous de les connecter dans le sens d&#39;écoulement droite. Une mauvaise connexion ne sera pas seulement de compromettre l&#39;expérience prévue, mais il peut aussi contaminer le système de livraison. </li></ol></li><li> Vérifiez pour des fuites en scellant la sortie de la chambre de mélange du dispositif de relance. Assurez-vous que tous les débits d&#39;air avant que le dispositif de relance maintenant tomber progressivement à zéro. Sinon, vérifier les fuites qui peuvent maintenant être identifiées par le sifflement de l&#39;air sortant du système. </li><li> Soigneusement transférer 15 mouches individuelles aux 15 tubes de verre individuels en utilisant un aspirateur et des tubes de verre à proximité des deux côtés avec les adaptateurs correspondants. Remarque: Parce que le système doit être fermé hermétiquement pour des expériences réussies, veiller à ce que les adaptateurs intègrent des tubes de verre hermétiquementet notent que des tubes de verre peuvent se briser lors de cette étape. Prenez soin d&#39;éviter les blessures en portant des gants et des lunettes de protection. </li><li> Raccorder les tubes de verre à la configuration Flywalk et, à partir de maintenant, attendez au moins 15 min avant de commencer l&#39;expérience pour permettre mouches habituent au nouvel environnement. </li><li> Après la fixation des tubes de verre: vérifiez la lecture des compteurs de débit en aval numériques sur ordinateur 1 si les 16 débits d&#39;air après les tubes de verre ajouter à la circulation de l&#39;air dans le système. Jetez également un coup sur l&#39;ordinateur 1, si l&#39;humidité est entre 60% et 80%. </li><li> Conception protocole de relance contrôler la séquence et le calendrier des stimuli d&#39;odeurs présentées aux mouches. Pour obtenir les données décrites par exemple, présents 4 odeurs et le contrôle (de l&#39;huile minérale) isolés et tous ternaire possible et les mélanges quaternaires des odeurs simultanément pour 40 fois chacun. Définir la durée d&#39;impulsion de 500 ms à un intervalle de 90 secondes interstimulus et aléatoire séquence de relance. </li><li> Allumez le lisource de lutte (LED-cluster; λ = 630). Assurez-vous de fournir assez de lumière pour le suivi efficace sans augmenter la température à l&#39;intérieur des tubes de verre. </li><li> Mettre en place une région d&#39;intérêt du système de suivi de piste en faisant glisser une trame à travers la zone à surveiller de manière à ce que les 15 tubes de verre sont incluses et environ 5 mm des bords des tubes sont exclus. </li><li> Mettre en place 14 lignes de séparation parallèles entre les tubes individuels dans le système de suivi en changeant leurs positions Y dans le script correspondant à garder individu vole identifiable tout au long de l&#39;expérience. Assurez-vous de les positionner de telle sorte qu&#39;il y ait toujours un tube de verre entre deux de ces lignes de séparation, car une seule mouche sera suivie entre un ensemble de deux lignes. </li><li> Assurez-vous de définir les paramètres de l&#39;appareil photo de manière à ce que les mouches sont suivis de façon fiable à travers les tubes de verre. Si les mouches sont perdus sur les bords de la région d&#39;intérêt, augmenter la luminosité ou le gain de poursuite software. Eviter les vibrations mécaniques du système de suivi. Suivre aide de logiciels commerciaux conformément au protocole du fabricant. </li><li> Début de l&#39;expérience en lançant le protocole de relance. Enregistrez flies&#39; XY coordonnées à 20 fps (images par seconde) et connectez-vous en combinaison avec l&#39;état de la vanne d&#39;odeur dans des fichiers texte. </li></ol> Analyse des données 3. REMARQUE: Les étapes suivantes dans l&#39;analyse des données sont automatisées utilisant des routines écrites personnalisées programmées dans R. Parce que ces étapes sont essentielles pour obtenir des résultats significatifs de l&#39;analyse sera néanmoins présenté d&#39;une manière étape-par-étape. Les données brutes pour l&#39;analyse sont .csv fichiers contenant des informations sur l&#39;état synchronisé de la soupape d&#39;odeur, nombre d&#39;impulsions dans l&#39;expérience et la mouche x 15 positions en cm sur un axe des temps commun pour cycle de stimulation d&#39;une odeur. Le code personnalisé pour l&#39;analyse des données peut être fourni sur demande. <ol><li> Ouvrir fichier .csv, trouver le temps-point de ouverture de la soupape signifié par un chaESN dans la colonne représentant l&#39;état de la vanne. </li><li> Calculer la fonction linéaire de la position de l&#39;odeur de la forme f (t) = S * t + i où t est le temps dans le cycle de stimulation, s est la vitesse du vent (ici 20 cm / sec) et l&#39;interception i peut être calculée selon le temps point l&#39;odeur pénètre dans les tubes à la position 0 (ouverture de la vanne, plus de retard). </li><li> Trouver le point de moment où l&#39;odeur et voler position x croisent pour chaque volée et régler ce temps-points à 0. Remarque: De cette façon, les positions de mouches sont alignés à chaque individual&#39;s rencontre avec l&#39;odeur. </li><li> Exclure les mouches assis sur les bords mêmes de la région d&#39;intérêt. </li><li> Calculer la vitesse à partir de X-positions en divisant le déplacement le long de l&#39;axe x par l&#39;intervalle de temps (100 ms) et répéter la procédure pour chaque cycle de stimulation. </li><li> Pour obtenir vitesse-temps des cours comme le montre la figure 2E calculer la vitesse moyenne du temps bien sûr pour chaque volée et l&#39;odeur et de ceux l&#39;évolution temporelle moyenne pour une odeur donnée. </li><li> Pour obtenir déplacement net, comme indiqué dans la figure 3C calculer le déplacement net dans les 4 secondes après l&#39;impulsion de l&#39;odeur pour chaque événement de suivi et après le déplacement net moyen par volée et l&#39;odeur. </li></ol> Procédure de nettoyage 4. <ol><li> Nettoyer le verre Tubes <ol><li> Retirer les mouches et les adaptateurs de tubes de verre et profiter des tubes de verre dans un détergent. </li><li> Rincer tubes de verre sous l&#39;eau distillée en cours d&#39;exécution et les sécher avec de l&#39;air sous pression. </li><li> Des tubes de verre à la chaleur à 200 ° C pendant 8 h. </li></ol></li><li> Système de livraison de l&#39;odeur propre <ol><li> Retirer tous les flacons d&#39;odeur et les tubes de la chambre de mélange centrale. </li><li> Retirer les adaptateurs de tubes de la chambre de mélange. </li><li> Chambre de mélange propre en le rinçant avec une solution de nettoyage de laboratoire et des solvants (par exemple l&#39;éthanol, l&#39;acétone). Effectuez ces étapes sous le capot de laboratoire. </li><li> Chambre de mélange à sec avec de l&#39;air sous pression et chauffer à 200 ° C pendant 8 heures. </li></ol></li><li> Nettoyer Odeur Flacons et clapets anti-retour <ol><li> Retirez le bouchon en acier (joint en caoutchouc de défausse) et clapets anti-retour à partir de flacons d&#39;odeurs et de tremper tous les composants dans une solution de nettoyage de laboratoire. </li><li> Soniquer composants dans un bain à ultrasons et les rincer avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Nettoyez tous les composants sauf clapets avec de l&#39;éthanol et de l&#39;acétone. Effectuez ces étapes sous le capot de laboratoire. </li><li> Composants secs avec de l&#39;air sous pression et de la chaleur entre eux à 200 ° C pendant 8 heures. </li><li> Clapets de retenue propre à l&#39;intérieur en les rinçant avec de l&#39;acétone et de l&#39;éthanol en utilisant une seringue (considèrent sens de l&#39;écoulement). Effectuez ces étapes sous le capot de laboratoire portant des lunettes de laboratoire. Parce que l&#39;acétone attaque pièces en caoutchouc, immédiatement clapets secs en les rinçant avec de l&#39;air sous pression. </li><li> Éliminer les odeurs résiduelles en pulsant de l&#39;air dans les clapets pendant plusieurs jours. Utilisez un incubateur à 60 ° C et un air sec sur 1/1 sec air hors régime pour cette étape de nettoyage. </li></ol&gt; </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Bien que le système Flywalk semble assez sophistiqué, à première vue, une fois mis en place et en cours d&#39;exécution, il est facile à utiliser et produit des résultats très robustes. Pour souligner la cohérence des résultats obtenus avec le dosage biologique, on peut dire que les résultats représentatifs présentés ici ont été obtenues presque 2 ans après que certains des résultats présentés dans une étude précédente 29 avec une configuration modifiée à l&#39;aide d&#39;un nouveau l...

L&#39;objectif primordial de toute recherche neuroethological est d&#39;établir un lien de causalité entre les états d&#39;activité de neurones individuels ou circuits neuronaux et le comportement d&#39;un organisme. Pour atteindre cet objectif de l&#39;activité neuronale et le comportement doit être surveillée dans des conditions identiques de relance et ces conditions de relance devrait idéalement être similaires à ceux du système nerveux sous surveillance évolué pour donner un sens. Particulièrement quand il vient à des essais biologiques du comportement, ces exigences ont historiquement prouvé très exigeant dans Drosophila melanogaster neuroéthologie olfactif. Une fois libéré de la source, des panaches d&#39;odeur éclatent rapidement, en filaments minces avec la diffusion turbulente causé par le mouvement de l&#39;air étant le principal déterminant de la distribution d&#39;odeur 1. En conséquence, un insecte naviguer vers une source d&#39;odeur subit une stimulation intermittente avec des paquets d&#39;odeurs avec des intervalles variables entrecoupées d&#39;air propre. Les deuxla marche et les insectes volants - y compris la drosophile - ont été démontrés à exploiter ce régime de stimulation intermittente pour la navigation par vent sur ​​la flambée rencontre panache et principalement déplaçant vent de travers en l&#39;absence d&#39;odeurs 2 - 5. Considérant que les procédures de stimulation dans des expériences physiologiques imiter largement celles d&#39;un insecte peut vivre dans son environnement naturel, soit en fournissant bouffées simples d&#39;odeurs entrecoupées de longues périodes de l&#39;air ou des séquences de stimulation dynamiques 6 - 11, de nombreux essais biologiques comportementaux utilisés dans Drosophila neuroéthologie tels que dosage de piège , arènes en plein champ ou T-labyrinthe reposent sur ​​odeur gradients 12 - 15. Toutefois, en raison des gradients odeurs, par définition, sont variables en fonction de la concentration distance de la source des odeurs, un comportement particulier peut pas être attribuée à une concentration d&#39;odeur précis en utilisant ces paradigmes. En outre, la pente deun gradient d&#39;odeur dépend de façon critique sur les propriétés physico-chimiques de la substance odorante. Un gradient d&#39;un composé très volatil sera moins profonde que celle créée par un composé moins volatile et donc plus difficiles à suivre pour un organisme comptant sur ​​la mesure des différences de concentration dans l&#39;espace comme les seuls moyens de navigation 16 - 20, ce qui peut conduire à une mauvaise interprétation des préférences olfactives notamment dans des essais de choix. Cet effet est également très préjudiciable lors d&#39;enquêtes sur les comportements vers des mélanges d&#39;odeurs car elle conduit à différents rapports de composants de mélange à chaque point de l&#39;espace et donc à nouveau interdit à une corrélation claire entre la physiologie et le comportement. Alors que des mouches du vinaigre ont tendance à se rassembler dans la fermentation de fruits, ils sont solitaires dans leur navigation vers les sources de nourriture et des sites de ponte. Néanmoins, plutôt que de tester les animaux individuels de nombreux paradigmes comportementaux utilisés chez la drosophile neuroetholoGY examiner le comportement de l&#39;odeur-guidée de cohortes de mouches et de l&#39;attraction est marqué comme la fraction de mouches qui choisissent l&#39;odeur sur une relance de contrôle. Ces expériences de cohorte ont grandement contribué à la compréhension de la mouche neuroéthologie et la plupart des observations faites par leur utilisation pourrait être confirmé dans des expériences unique mouche. Cependant, il a été observé que les mouches peuvent influencer chaque décision other&#39;s 21 et dans les cas extrêmes, l&#39;évaluation d&#39;une odeur peut passer de l&#39;indifférence à l&#39;évitement selon la densité de la population 22. En outre, les résultats de ces types d&#39;expériences fournissent souvent uniquement le point de terminaison d&#39;une séquence de décisions comportementales plutôt que d&#39;observer ce qui fait à la volée tout en elle le fait, ce qui serait souhaitable lorsque l&#39;on tente de mettre en corrélation avec le comportement de l&#39;activité neuronale. Ces expériences de cohorte plutôt faible résolution sont contrastés par haute résolution méthodes seule mouche comme les arénas de vol captif et tapis roulants qui permettentpour une observation directe des réponses comportementales au moment où le stimulus est présenté 20,23,24. Néanmoins, les expériences de la cohorte sont toujours populaires, car ils sont très efficaces et fournissent des résultats robustes, même à comparable tailles bas-échantillons, car la variabilité inter-individuelle et inter-procès sont partiellement en moyenne en raison de l&#39;observation de populations sur des périodes de temps prolongées. Bien vol captif et tapis roulant offrent probablement la norme d&#39;or concernant la présentation du stimulus et résolution temporelle, les arènes utilisés sont conçus pour les animaux simples et il est donc temps pour obtenir des tailles d&#39;échantillon nécessaire pour une analyse statistique. Plusieurs autres approches ont été récemment mis au point qui permettent une acquisition efficace des données comportementales à haute résolution en combinaison avec un régime de relance bien défini. Ceux-ci comprennent sans surveillance suivi 3D de plusieurs mouches du vinaigre dans une soufflerie en combinaison avec un modèle 3D précise de l&#39;odeur panache 5 </sup&gt;, suivi de plusieurs mouches individuels dans les chambres de choix fournis avec les courants d&#39;air des deux côtés 25 et le paradigme Flywalk 26. Dans Flywalk, 15 mouches individuelles sont situées dans de petits tubes de verre et surveillés en permanence par une caméra de tête dans des conditions de lumière rouge. Les odeurs sont ajoutés à un courant d&#39;air continu de 20 cm / sec et voyagent à travers les tubes de verre à une vitesse constante. Le courant d&#39;air est humidifié par passage à travers flacons de 250 ml contenant de l&#39;eau distillée (humidificateurs) avant d&#39;entrer dans le système de distribution d&#39;odeur. Les positions de flies&#39; sont enregistrées dans une région carrée d&#39;intérêt (ROI) qui englobe la majeure partie de la longueur des tubes d&#39;odeurs (à l&#39;exclusion des bords extérieurs des tubes (environ 5 mm de chaque côté), où les mouches peuvent pas se déplacer plus haut ou vent arrière) à l&#39;époque de la présentation de l&#39;odeur (figure 1A, B). Aller identités sont maintenues constantes par le système de suivi tout au long de l&#39;expérience sur la base de leurs positions Y (ie leurs limites d&#39;tube de verre). Stimulation de l&#39;odeur est réalisé en utilisant un dispositif de stimulation multi-composant qui permet la présentation d&#39;un maximum de 8 et de toutes les odeurs simples mélanges de ceux-ci possibles 26,29 (figure 1B). Le cours d&#39;un essai est commandé par un ordinateur de régulation du système de délivrance et de collecte de l&#39;odeur température et d&#39;humidité de l&#39;information (ordinateur 1, la figure 1C). Cet ordinateur contrôle également un enregistreur de données (démarrage / arrêt de l&#39;enregistrement) sur un deuxième ordinateur qui permet de suivre en permanence les positions de voler à 20 images par seconde (2) informatiques. Fly positions, état ​​de la vanne d&#39;odeur (c.-à-point dans le temps de l&#39;ouverture de la vanne), l&#39;odeur ID, ​​la température et l&#39;humidité autour de cycles de stimulation de l&#39;odeur sont enregistrés sur l&#39;ordinateur 2. De cette façon, des informations sur l&#39;odeur et la mouche positions sont synchronisés et exportés au format .csv fichiers qui peut encore être traitées et analysées en utilisant les routines d&#39;analyse écrite sur mesure. En raisonl&#39;ensemble du système est contrôlé par ordinateur, sans intervention humaine est nécessaire au cours d&#39;une session expérimentale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="866">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flywalk setup</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:207px;">details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stimulus device</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LED cluster</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>details available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HD Pro Webcam C920</td>
			<td style="width:325px;">Logitech, Lausanne, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 Computers</td>
			<td style="width:325px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Flywalk Reloaded v1.0 software</td>
			<td style="width:325px;">Electricidade Em P&#243; (electricidadeempo.net)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labview 11.0 software</td>
			<td style="width:325px;">National Instruments, Austin, TX</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard fly food</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Standard fly vials</td>
			<td style="width:325px;">Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard fly vials</td>
			<td style="width:325px;">Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">aspirator</td>
			<td style="width:325px;">Custom</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mineral oil</td>
			<td style="width:325px;">Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">odors</td>
			<td style="width:325px;">Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">200 &#181;l PCR reaction tubes</td>
			<td style="width:325px;">Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution quantification of odor-guided behavior in drosophila melanogaster using the flywalk paradigm

Dans leur milieu naturel, les insectes comme la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster sont bombardés avec une énorme quantité de substances odorantes chimiquement distinctes. Pour compliquer encore les choses, les odeurs détectées par le système nerveux des insectes sont généralement pas de composés simples, mais les mélanges dont la composition et les ratios de concentration varier. Ceci conduit à une quantité presque infinie de différents stimuli olfactifs qui doivent être évaluées par le système nerveux. Pour comprendre quels aspects d&#39;une relance de l&#39;odeur de déterminer son évaluation par la mouche, il est donc souhaitable d&#39;examiner efficacement le comportement des odeurs guidé vers de nombreuses substances odorantes et mélanges d&#39;odeurs. Pour corréler directement le comportement de l&#39;activité neuronale, le comportement doit être quantifiée dans un délai comparable et dans des conditions identiques à celles de relance dans des expériences neurophysiologiques. Cependant, de nombreux essais biologiques olfactifs actuellement utilisés chez la drosophile neuroéthologie sont plutôt spécialisée soit vers l&#39;efficacité ou vers la résolution. Flywalk, un système de livraison de l&#39;odeur et de suivi automatisé, comble le fossé entre l&#39;efficacité et de la résolution. Il permet de déterminer exactement quand un paquet d&#39;odeur stimulé une mouche marchant librement, et de déterminer les animal&#39;s réaction comportementale dynamique.

Étant donné que les mouches sont autorisés à distribuer librement dans leurs tubes de verre entre les impulsions d&#39;odeur et l&#39;impulsion d&#39;odeur se déplace à travers les tubes de verre à une vitesse constante vol rencontrent l&#39;odeur à des moments différents en fonction de leur position-x au moment de la stimulation. En conséquence, les onsets des trajectoires au vent évoqués par une impulsion ms 500 d&#39;une jolie 10 -3 dilution de l&#39;acétate d&#39;éthyle sont décalées d&#39...

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High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Le Flywalk système de suivi automatisé est utilisé pour la haute résolution de quantification comportement d&#39;odeur guidé dans Drosophila melanogaster.

Haute résolution La quantification du comportement Odor-guidée dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilisation de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

high-resolution-quantification-odor-guided-behavior-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

9.2K vues.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  Le Flywalk système de suivi automatisé est utilisé pour la haute résolution de quantification comportement d'odeur guidé dans Drosophila melanogaster. 

Vidéo: High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Enregistrements Sensillum simple chez les insectes Drosophila melanogaster Et Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Recherche

Neurosciences

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Enregistrement simultané des signaux calciques de neurones identifiés et le comportement alimentaire des Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimulation optogenetic de comportement de fuite en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Détermination de l&#39;activité locomotrice spontanée,<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Essai simple pour la quantification de l&#39;évitement social en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un moyen simple pour mesurer Transformations en récompense le comportement de recherche Utilisation<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Capillaire Feeder Assay mesures prise alimentaire dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantification du comportement de toilettage de la drosophile

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.