We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

Remarque: Pour cette étude, des cellules stromales mésenchymateuses du poumon (LR-MSC) à partir de tissu pulmonaire distale ont été isolés soit en fonction de leur expression de marqueurs de surface cellulaire (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 élevé, EpCAM neg) 14,15, à l&#39;aide explantation hors croissance de 16, ou en utilisant une digestion enzymatique 17. LR-adhérent CSM ont été cultivées dans du DMEM riche en glucose avec et sans glutamine, 15% de FBS, de la glutamine mM antibiotique / antimycotique, et deux 1x (médias désormais complet) et on incube à 37 ° C, 5% CO 2. LR-MSC ont été passées 3-4 fois afin d&#39;assurer une population de cellules ayant des caractéristiques de croissance relativement homogènes pour l&#39;essai de migration. 1. Préparation d&#39;une monocouche confluente <ol><li> Pour détacher MSC de boîtes de culture de 100 mm, laver les cellules avec 10 ml de 37 ° C préchauffé PBS, aspirer le PBS et ajouter 4 ml de trypsine (0,25%). Incuber 3 à 5 min dans un incubateur à 37 °. Aspirer le cElls dans un tube conique, ajouter un volume égal de milieu complet et centrifuger à 300 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules vers le bas. Remarque: incubation plus long peut modifier la trypsine dans les récepteurs de la surface cellulaire et potentiellement affecter la migration. </li><li> Aspirer le milieu et remettre les cellules dans un milieu complet frais. Compter les cellules, à l&#39;exclusion des cellules mortes en utilisant exclusion du bleu trypan et de la plaque de cellules stromales mésenchymateuses 500.000 dans 4 ml de milieu complet sur une boîte de culture cellulaire de 60 mm. Note: En fonction de la source des cellules, des tests peuvent être nécessaires pour déterminer le nombre optimal de cellules nécessaires. </li><li> Incuber les cellules jusqu&#39;à ce que les plaques sont 90% de confluence pour une fixation optimale des cellules et la prolifération, habituellement 48-72 h pour MSC. Remarque: 100% de confluence est pas recommandé, car un grand nombre de cellules expérience inhibition de contact de l&#39;ancrage à charge, ce qui peut modifier leur capacité migratoire. Plaques avec moins de 80% de confluence se traduira par des photos inutilisables parce que le logiciel d&#39;analyse d&#39;image va interpréter écarts entre les cellules dans le cadre du périmètre de la rayure (voir figure 1D). </li><li> Après que les cellules ont atteint 90% de confluence, les cellules comme endommager approprié pour l&#39;application. Pour évaluer les dommages cellulaires après exposition à soluble extrait de la fumée de cigarette (CSE), générer 100% CST en dessinant la fumée à partir du 1er Université du Kentucky cigarette de recherche (3R4F) à travers 25 ml de milieu complet dans un flacon Büchner plus de 2 min 18. </li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures dans 4 ml 1-4% CST diluée dans un milieu complet. Après incubation, laver les cellules deux fois avec 4 ml de PBS chaud stérile, avant de remplacer avec 4 ml de milieu complet frais. Remarque: endommager les cellules avec des concentrations élevées de l&#39;extrait de la fumée de cigarette (&gt; 5%) peut réduire sensiblement la confluence. </li></ol> 2. Création du Scratch <ol><li> Dans un environnement stérile, retirer le couvercle de la plaque de 60 mm de MSC endommagés, et de jeter un bord droit (par exemple, une règle en plastique stérilisé) across le rebord supérieur de la plaque. Sans retirer le support, utiliser une pipette de 200 pi stérile guidée par le straight-edge stérile pour faire de un à quatre rayures parallèles à travers la plaque d&#39;environ 5 mm d&#39;intervalle et 50 mm de long. Remarque: A bord droit minimise la quantité de réglages en rotation nécessaires à la plaque quand il est sur la platine du microscope. Il est impératif que les rayures apparaissent complètement verticale (ou horizontale) sur l&#39;écran. Générer de multiples rayures sur une plaque de 60 mm ne modifie pas le micro-environnement d&#39;une manière qui affecte la migration des cellules (données non présentées), mais elle peut être une considération pour les autres types de cellules. L&#39;utilisation de petits puits est déconseillé car la variabilité de la croissance de cellules près du bord du puits devient plus prononcée et peut affecter la génération uniforme de rayures. </li><li> Aspirer les médias et laver délicatement les plaques avec 2 ml de milieux complets pré-chauffé pour empêcher les cellules d&#39;adhérer au centre de la rayure, et de supprimer la cellules qui ont été ébranlée par le grattage. Remplacer avec 4 ml de milieu complet frais. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un marqueur permanent stérile, étiqueter chaque scratch parmi 1-4 sur la face inférieure de la plaque à l&#39;emplacement qui ne sera pas interférer avec l&#39;imagerie des rayures. Remarque: Il est important que les images de la même zéro sont comparés avant et après la migration, car il peut y avoir des variations dans la largeur de zéro. </li></ol> 3. Prenant images initiales de la rayure Remarque: Si le dosage de zéro est effectuée sur des plaques multiples, il est recommandé que les images initiales de toutes les rayures sur une seule plaque sont prises avant rayures sont faites sur la plaque suivante. <ol><li> Utiliser un microscope à contraste de phase inversée avec un appareil pour générer les images nécessaires à l&#39;analyse. </li><li> Placer la plaque de culture sur le microscope, et d&#39;utiliser l&#39;objectif de faible puissance (10X) pour localiser zéro # 1. Si de la condensation sur le couvercle de la plaque de culture est une entrave claire image des cellules, utilisez un ensemble de stade chauffé à 37 ° C. </li><li> Garder le scratch complètement horizontal et dans le centre du champ de vision, obtenir autant d&#39;images que nécessaire pour englober 90% de la longueur de la rayure. Obtenir des images de parties distinctes de la rayure sans chevauchement entre les images. Remarque: La réfraction de la lumière sur les bords de la boîte de culture surexpose les images, ce qui les rend impossibles à analyser. Par conséquent, ne pas prendre des images de la première et dernière 5% de la longueur de la rayure. </li><li> Enregistrez les images de chaque zéro dans un dossier distinct. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.4 pour les égratignures 2, 3, et 4. </li><li> Remettre les assiettes à l&#39;incubateur immédiatement après l&#39;imagerie initiale. Laissez cellules migrent pour 4-7 heures. Remarque: 7 h est optimale lors de l&#39;évaluation MSC endommagés avec le CST. Incubation des cellules pendant plus de 7 heures est pas recommandé car la prolifération cellulaire peut agir comme un facteur de confusion pour la migration cellulaire (voir la note 8.2 ci-dessous en option). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analyse initiales Scratch Images <ol><li> Télécharger ImageJ et installer le plugin de guérison des plaies outil (se référer à la Table des Matières / Équipement). </li><li> Ouvrez le fichier d&#39;image dans ImageJ, puis cliquez sur &quot;Process&quot; et &quot;Trouver Edges&quot; de mettre en évidence les cellules environnantes le scratch pour la guérison des plaies outil pour calculer l&#39;aire de zéro (figure 2B). Ensuite, cliquez sur &quot;Image&quot;, &quot;Ajuster&quot;, &quot;Seuil de couleur&quot; et dans le menu déroulant intitulé &quot;Seuil de couleur&quot; changer la valeur de &quot;B &amp; W.&quot; </li><li> Dans le menu &quot;seuil de couleur&quot;, régler les deux curseurs de seuil de luminosité jusqu&#39;à ce contraste optimal entre le zéro et la cellule avant est atteint. Afin de permettre la plus grande gamme en essayant de créer contraste de l&#39;image, déplacez le curseur en bas complètement à droite (image complètement noire), puis ajustez le curseur dessus pour générer un contraste maximum. </li><li> Ajuster lentement le bri topghtness curseur de gauche à droite jusqu&#39;à ce que l&#39;image affiche proprement le contour de la rayure (figure 2C). Une fois les bords de la rayure ont été identifiés, cliquez sur &quot;Plus Outils» dans la barre d&#39;outils ImageJ, sélectionnez &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; dans le menu déroulant, puis appuyez sur la touche &quot;m&quot; (qui apparaîtra dans la barre d&#39;outils ImageJ) pour mettre en évidence la zone de zéro et la sortie de la zone calculée dans une fenêtre de résultats pop-out (figure 2D). </li><li> Copier et coller tous les numéros de la fenêtre des résultats (figure 2E) dans un tableur Excel. Assurez-vous de séparer les données individuelles des égratignures. </li></ol> 5. Compte Images finales du Scratch <ol><li> Après que les cellules ont migré (4-7 heures), répétez les étapes 3.2 à 3.4. Image les plaques dans le même ordre qu&#39;ils ont été rayés de sorte que les cellules sur chaque plaque ont eu le temps égal à migrer. Remarque: Les cellules peuvent être visualisés à de multiples points dans le temps, en fonction de leur sensitivité à la fois des changements de température et de pH. Alternativement, imagerie de cellules vivantes peut être utilisé pour suivre les cellules en temps réel lors de leur migration. </li></ol> 6. Analyse finales Scratch Images <ol><li> Répétez les étapes 4.2 à 4.5 pour des images de Final Scratch. </li></ol> 7. Calcul de la zone de Scratch pour quantifier la migration <ol><li> Calculer la superficie moyenne de pré-migration par la moyenne des valeurs de la zone de départ des rayures respectifs. </li><li> Calculer le montant total de la migration en soustrayant la zone de migration finale pour chaque image, calculée à l&#39;étape 6, à partir de la zone de pré-migration moyenne (étape 7.1). Générer une liste de valeurs pour chaque zéro représentant l&#39;évolution de la migration. </li><li> Regrouper les données provenant de plusieurs rayures à l&#39;intérieur du même groupe d&#39;essai (à savoir toutes les plaques et les griffes sur les cellules exposées à 0% CSE). Utiliser une analyse de l&#39;essai Écart d&#39;analyser les différences entre les groupes expérimentaux. </li><li> Si les cellules sont lentes à migreret exiger un temps d&#39;incubation plus longue après grattage (supérieure à 12.10 h), effectuer une BrDU ou EdU incorporation test 19 pour déterminer si les cellules sont en cours de prolifération pendant toute la période pendant laquelle l&#39;essai de migration est en cours. Choisir un temps d&#39;essai de migration pour éviter la prolifération cellulaire significative. </li></ol> 8. Facultatif <ol><li> Pour évaluer si la sénescence cellulaire importante est en cours à la suite de la procédure de grattage, effectuer une bêta-galactosidase dosage de la sénescence associée sur une plaque d&#39;essai à des moments prédéterminés après grattage 19. </li></ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber.">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li><li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules.">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence:+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay.">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Le protocole décrit ici offre une méthode quantitative robuste standardisée pour réaliser et analyser les tests de grattage. Dosages à gratter simples sont couramment utilisés dans de nombreux domaines d&#39;étude pour examiner la migration cellulaire. Cependant, traditionnellement le dosage de zéro a manqué un set-up et la quantification protocole standardisé, qui a conduit à des problèmes avec la reproductibilité 7,10. Beaucoup de modifications et optimisations pour améliorer le dosage de zér...

La migration cellulaire est hautement coordonnée et essentielle pour de nombreux processus physiologiques tels que le développement des tissus, la réparation et la régénération, ainsi que des processus pathologiques tels que les métastases du cancer et une artériosclérose. Une bonne compréhension de la migration cellulaire est particulièrement pertinent pour les nouvelles thérapies utilisées pour réparer les tissus endommagés et traiter des conditions pathologiques, y compris les technologies de transplantation de cellules et de tissus artificiels greffage 2. Compte tenu de l&#39;intérêt actuel pour le rôle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans la médiation de la réparation des tissus 3, la quantification de la capacité de migration de ces cellules en utilisant un dosage qui est rigoureusement quantifiables, adaptable et rentable est d&#39;intérêt. Surtout, un tel essai doit être suffisamment sensible pour détecter des changements relativement subtiles dans la capacité migratoire cellulaire après les dommages. Les méthodes actuelles pour quantifier la migration des cellules, y compris des essais à gratter, des essais de migration trans-puits (Boyden chambres), tableaux micropilier et l&#39;exclusion de la zone cellulaire tests possèdent une gamme de limitations dans la reproductibilité, de personnalisation, de quantification et coût-efficacité 1,4,5. Le dosage de zéro optimisé décrit ici démontre des résultats robustes, des capacités d&#39;analyse et quantifiables basés sur l&#39;image, coût-efficacité, l&#39;adaptabilité et à d&#39;autres applications. Des dosages de grattage ont été utilisés dans de multiples capacités d&#39;évaluer la migration et la prolifération cellulaire dans différentes conditions expérimentales 5. Le test implique l&#39;ensemencement des cellules désignées, les cultiver à compléter ou à proximité de la confluence, et gratter la monocouche résultant avec une aiguille stérile ou pipette 6. L&#39;analyse est le plus souvent réalisée en comparant la largeur de la rayure sur plusieurs points de temps à des endroits choisis au hasard 7-9. En dépit de son utilisation importante, l&#39;essai de rayure est confondu par des problèmes avec la reproductibilité et la quantification. La variabilité dansgénération de la rayure ne modifie pas le micro-environnement des cellules, mais peut également empêcher la migration des cellules en endommageant la surface de la plaque sous-jacente et la matrice extracellulaire-5. Les dosages sont effectués fréquemment plus de 7 à 12 heures, mais pour des lignées cellulaires présentant migration plus lente et de plus longs temps de dosage, la prolifération devient un facteur de confusion 7,10. Enfin, les cellules sénescentes générés par le processus de grattage peuvent libérer des facteurs qui interfèrent avec la signalisation extracellulaire nécessaire pour combler l&#39;écart dans la monocouche 1. Optimiser le dosage de zéro nécessite la création d&#39;un espace cohérent qui ne perturbe pas les propriétés de surface, ce qui minimise dosage longueur de temps, et de prévenir la mort des cellules non désirées lors de la manipulation. Le dosage est basé bouchon une optimisation du dosage d&#39;une zone d&#39;exclusion de cellules. Cet essai utilise un bouchon placé au milieu du puits, qui exclut la croissance des cellules, mais permet aux cellules d&#39;être plaqués autour de la zone d&#39;exclusion central.Pour évaluer la migration, le bouchon est enlevé, et la zone d&#39;exclusion résultante fournit une surface pour la migration se produise. Toutefois, ce dosage est difficile pour personnaliser ou adapter 10 et pour certaines applications, cette technique peut également être prohibitif. Contrairement aux tests de grattage et de leurs dérivés, des tests de migration trans-de puits (ou de Boyden dosages de chambre) évaluer la migration en quantifiant le nombre de cellules qui se déplacent d&#39;une chambre, à travers une membrane de filtration microporeuse, dans une chambre contenant des agents chimiotactiques 8,11, 12. Cette technique a une utilité limitée pour les cellules adhérentes comme MSC, car après la migration à travers la membrane poreuse, les cellules adhèrent au côté de la membrane exposée aux agents chimiotactiques, et peuvent être difficiles à quantifier avec précision. Alors que le test est en mesure d&#39;examiner certains schémas de migration en trois dimensions, les types de cellules restreintes pour lesquelles il est en mesure de quantifier avec précision la limite de la migration des cellules de son utilitaire 10. Une autre alternative pour des essais de rayure utilise une matrice de micro-colonne, qui mesure la motilité cellulaire à travers un espace à trois dimensions en utilisant la capacité des cellules à se déformer et à migrer dans la matrice en tant que substitut. Polydimethlysiloxane (PDMS) élastomères durcis sur un moule précis et traités avec de l&#39;ozone et de la fibronectine produit un micro-environnement homogène et non dégradable. Micro-pilier espacement peut également être modifié selon les besoins pour évaluer la capacité des cellules pour entrer dans le tableau 4. Le moule est créée par profonde gravure ionique réactive de plaquettes de silicium pour créer une version négative de la haute rapport d&#39;aspect 13 gamme. Bien que le dosage est renforcé par sa personnalisation, la capacité de modéliser la migration en trois dimensions, et l&#39;analyse par la visualisation directe des cellules migrantes, la difficulté à créer des réseaux de micro-pilier économique empêche son utilisation généralisée. Le dosage de zéro optimisé décrit dans ce protocole offre une efficacité, des cosProcédé de t-efficace pour produire des rayures uniformes qui peuvent être analysées en utilisant un logiciel disponible gratuitement. Au lieu de simples mesures de largeur faites à travers le scratch avant et après la migration cellulaire, le logiciel permet à l&#39;utilisateur de déterminer les zones à gratter totaux avant et après la migration. Cet avancement limite la question d&#39;essayer de déterminer où le zéro les mesures de largeur doivent être prises, et si la largeur de la rayure est uniforme le long de sa longueur. En outre, une optimisation soignée du nombre de cellules, la confluence des cellules et le type et le degré de dommages infligés aux cellules est discutée afin d&#39;optimiser le dosage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Les tests de grattage présentées ici ont été réalisées en utilisant des cellules stromales mésenchymateuses résidents du poumon murins (LR-MSC) et isolés comme référence dans les notes de protocole. La LR-MSC ont été ensemencées à une densité de 500.000 cellules dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm, et cultivé à 90% de confluence en 48 heures. Pour générer des dommages, 4% CST (décrite ci-dessus) a été incubé avec les cellules pendant 24 heures après la période initiale d&#39;ensemenc...

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.8K vues.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Poisson zèbre kératocyte explants d&#39;étudier la migration cellulaire collective et réépithélialisation dans la cicatrisation cutanée plaies

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Recherche

Biologie du développement

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Développement d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Production et administration de la thérapeutique mésenchymateuses souches / cellules stromales (MSC) Spheroids apprêté dans les cultures 3-D dans des conditions d&#39;Xeno-libres

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / Wound Healing dans une plaque à 96 puits

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Un dosage de point à 5 mC Quantification du niveau de méthylation d&#39;ADN de la Dedifférenciation des chondrocytes<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

Le dosage de co-culture anneau aortique : Un outil pratique pour évaluer le potentiel angiogénique de cellules stromales mésenchymateuses In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualisation de la Migration cellulaire tangentielle dans le Tectum optique de poussin en développement

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...