Ce protocole fournit une nouvelle méthode pour une ancienne technique, et il fournira une nouvelle approche pour un grand nombre de chercheurs en sciences fondamentales. Les principaux avantages de cette technique sont sa nature rentable ainsi que son adaptabilité à utiliser par un public scientifique plus large. Pour préparer une plaque de migration, utilisez un marqueur permanent de couleur claire pour tracer une ligne au centre de l’arrière de chaque puits d’une plaque de puits de 48 et pour dessiner trois marques de hachage pour diviser chaque puits en trois zones d’intérêt distinctes.
Ensuite, plaque 1,5 à deux fois 10 au quatrième passage unique fibroblastes cardiaques dans chaque puits et la culture des cellules dans des conditions de culture normales pendant 24 à 48 heures jusqu’à ce qu’ils atteignent 90 à 95% confluency. Lorsque les cellules sont prêtes, retirez le supernatant de chaque puits et utilisez une pointe stérile de pipette P200 pour faire une égratignure d’un passage le long des lignes tracées. Rincer les puits avec un faible sérum moyen pour enlever les fibroblastes cardiaques non attachés et ajouter 500 microlitres de milieu de sérum faible à chaque puits.
Si des agents pharmacologiques sont utilisés, ajoutez les agents aux puits appropriés. Ensuite, utilisez un microscope inversé avec un objectif de 20x pour capturer deux images de zéro heure par puits en utilisant les marques pour positionner chaque puits pour permettre l’imagerie de la moitié supérieure de la ligne rayée. Déplacez ensuite la plaque pour positionner la moitié inférieure de la ligne rayée en vue de recueillir la deuxième image et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.
À la fin de l’incubation, lavez chaque puits avec du PVS non stérile et ajoutez 500 microlitres de 4% de paraformaldéhyde à chaque puits dans un capot de fumée. Après 10 minutes à température ambiante, laver chaque puits trois fois en PBS frais pendant cinq minutes par lavage. Après le dernier lavage, perméabiliser les cellules avec 300 microlitres de solution perméabilisante par puits et basculement doux pendant 30 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, remplacer la solution perméabilisante par une tache bleue brillante kumasi de 1 % pendant une incubation de 10 minutes par un basculement doux à température ambiante. Suivi de trois lavages de cinq minutes dans PBS avec basculement. Après le dernier lavage, ajouter 300 microlitres de PBS à chaque puits et positionner soigneusement la plaque dans la même position que pour l’image zéro heure avant de capturer deux images de 24 heures par puits et démontré.
À la fin de l’expérience, ouvrez les images et un logiciel d’analyse d’imagerie approprié et créez une nouvelle couche sur l’image zéro heure. Double clic pour changer le nom de la nouvelle couche de ligne de couche et sélectionnez l’outil brosse. Changez la taille du pixel à 10 et la couleur en rouge et dessinez deux lignes distinctes pour décrire l’égratignure.
Les lignes ne doivent toucher aucune cellule. Ouvrez l’image 24 heures sur 24 dans le logiciel d’imagerie et sélectionnez l’outil de déplacement. En maintenant le bouton de commande, cliquez à la fois sur les lignes et les couches d’arrière-plan, cliquez au centre de l’image zéro heure et faites glisser les deux couches au milieu de l’image 24 heures sur 24.
Dans l’image de 24 heures, cliquez sur la couche d’arrière-plan zéro heure et changer l’opacité à 50%Tenant le bouton de contrôle, cliquez à la fois sur l’arrière-plan zéro heure et les couches de ligne et cliquez sur modifier et transformer gratuitement pour transformer librement les couches En utilisant la transformation libre, aligner l’arrière-plan zéro heure et les images de ligne à l’image de fond 24 heures de sorte que les lignes de migration de zone sont positionnés correctement dans l’image de 24 heures. Lorsque la couche de ligne a été superposée avec succès, cliquez à droite pour supprimer la couche d’arrière-plan zéro heure. La couche de ligne restante peut être utilisée pour déterminer le nombre de cellules qui ont migré dans la zone d’éraflure pendant 24 heures.
Enregistrez ensuite la nouvelle image de migration en tant que fichier Photoshop et TIFF ou JPEG. Pour quantifier le nombre de cellules migrantes, ouvrez l’image de migration et un programme qui accepte les fichiers TIFF ou JPEG et compte manuellement le nombre de cellules situées entre les deux et touchant les deux lignes rouges pour chaque puits. Enregistrez ensuite le nombre de cellules migrantes par image.
Pour déterminer la zone de migration, ouvrez l’image 24 heures sur 24 qui contient les lignes de migration dans le logiciel d’imagerie et enregistrez l’image sous forme d’image de zone de migration. Après enregistrement, cliquez sur la couche d’arrière-plan et cliquez à droite pour supprimer la couche. Utilisez l’outil brosse pour remplir la zone entre les lignes de rayures, avec la même couleur qui a été utilisée pour les lignes et cliquez sur l’image, le mode et l’échelle grise pour changer l’image en noir et blanc.
Enregistrez l’image et ouvrez l’image de la zone de migration et un logiciel d’analyse d’image approprié. Cliquez sur modifier, et inverser. Pour déterminer la zone de la ligne de migration, cliquez sur l’image, ajustez et seuilz.
La zone de migration noire deviendra rouge et la zone en pourcentage sera indiquée dans la boîte de seuil. Enregistrez ensuite la zone de pourcentage pour la ligne de migration et confirmez que cette valeur est jumelée avec le nombre de cellules migratives pour la même image. Dans cette analyse, 46 fibroblastes provenant de cœurs non diabétiques et 129 fibroblastes provenant de cœurs diabétiques ont migré pendant la période expérimentale de 24 heures.
La mesure de la zone de migration, comme démontré, a révélé que la zone d’éraflure non diabétique s’est composée de 24,78 % de la superficie totale mesurée, tandis que la zone d’égratignure de migration diabétique s’est composée de 16,77 % de la superficie totale mesurée. La normalisation de la zone de migration fournit une évaluation meilleure et plus rigoureuse de la migration cellulaire et nie les erreurs humaines potentielles. Par exemple, si seulement le nombre de fibroblastes migrés est comparé, il semblerait dans cette analyse que le nombre de cellules qui ont migré dans ce puits était deux fois supérieur à celui des cellules migrées dans le deuxième puits.
Toutefois, lorsque la zone de l’égratignure a été utilisée pour normaliser les données, on a observé que le rapport entre les fibroblastes et la zone de migration était presque le même dans les deux puits. Assurez-vous de récupérer la zone de migration dans l’image de 24 heures, comme vous l’avez capturé dans l’image zéro heure. Après cette procédure, l’immunohistochimie peut être conduite pour examiner l’expression de protéine dans les cellules.
Nous croyons que cette nouvelle approche de l’analyse de la migration à gratter permettra d’ouvrir davantage d’avenues de recherche scientifique qui n’étaient pas disponibles auparavant.
