Nous tenons à remercier Patricia Wadsworth pour le don de la kinésine-5 construction. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (5 R01 GM107026) de TJM et par une subvention de recherche n ° 5 FY13-205 de la Mars de Dimes Foundation de TJM, ainsi que le soutien de la Fondation Charles H. capot, Inc., Boston, MA. à TJM

1. Les cellules transfectant S2 <ol><li> Du précédemment cultivées 25 cm 2 flacon, ajouter cellules GFP-a-tubuline exprimant S2 10 jusqu&#39;à un volume final de 2 ml à 100% de confluence, et leur permettre de semi-adhérer au fond d&#39;une boîte de culture tissulaire de 35 mm pour environ 1 h. </li><li> Retirez le support de l&#39;antenne. Transfecter 2 pg de l&#39;Eg5-mCherry construire 11 avec 1 ml de médias de Schneider complété avec 10% de FBS (appelé ci-après les médias Schneider) et réactif de transfection, en suivant le protocole du fabricant. Sceller le plat avec du Parafilm et incuber les cellules à 25 ° C pendant 16-18 h. </li><li> Ajouter 1 ml de médias de Schneider. Retour cellules à 25 ° C incubateur. </li><li> Au jour 3 post-transfection, transférer 500 pi de cellules transfectées dans une nouvelle boîte de culture de tissu de 35 mm contenant 1,5 ml de médias de Schneider pour une induction de test. Induire l&#39;expression de Eg5-mCherry en ajoutant CUSO4 </sub&gt; à une concentration finale de 500 uM. Sceller le plat dans Parafilm et incuber à 25 ° CO / N. </li><li> Lamelle de faire des lamelles de concanavaline A-enduit, pipette un volume suffisant de concanavaline Une solution (0,5 mg / ml dissous dans H 2 O) pour enrober un acide lavé, enlever l&#39;excès, et de permettre la lamelle à l&#39;air sec. </li><li> Placer un 22 mm x 22 mm concanavaline A-revêtu lamelle dans une boîte de 35 mm pour culture de tissu propre, puis ensemencer 500 ul à 100% de confluence des cellules induites sur la lamelle couvre-objet et de permettre aux cellules d&#39;adhérer pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Pour vérifier l&#39;expression Eg5-mCherry, assembler la lamelle dans une chambre de rose (ou navire d&#39;imagerie approprié) avec les médias pour l&#39;imagerie à la TA sur un microscope à fluorescence. Utilisez des sources lumineuses appropriées et jeux de filtres pour visualiser les cellules. Par exemple, le microscope utilisé dans cette étude a une source de lumière blanche LED et EGFP (FITC / Cy2) et DsRED (TRITC / Cy3) cubes de filtre. Eg5-mCherry localise aux microtubules et est enrichi de l&#39;AENpôles du fuseau r. </li><li> Après avoir vérifié que les cellules expriment à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline, transférer le reste des cellules non induites, transfectées à un 25 cm flacon de culture de tissu contenant 2 4 ml de médias de Schneider. </li><li> Ajouter Blasticidin S HCL à une concentration finale de 25 pg / ml dans le flacon de cellules transfectées et continuer fractionnement en présence de ml de HCl S 25 de pg / Blasticidin jusqu&#39;à la mort de la cellule cesse d&#39;être sûr de vérifier pour l&#39;expression de Eg5-mCherry périodiquement. Incuber les lignées cellulaires de 25 ° C incubateur. NOTE: Le pourcentage de cellules exprimant des augmentations Eg5-mCherry au fil du temps. </li><li> Une fois que les cellules sont transfectées de façon stable, continuer à diviser en l&#39;absence de médicaments et de geler 12 cellules pour une utilisation future. </li></ol> 2. Interférence ARN <ol><li> Amplifier par PCR une région de 500 pb ~ de Klp61F à partir d&#39;ADNc (LD15641) en utilisant une amorce avec une séquence de promoteur T7 supplémentaire (séquence fournie dans la liste des matériaux) pour êtreutilisé comme matrice pour la synthèse d&#39;ARNdb. <ol><li> Mettre en place quatre réactions de PCR, 50 ul, contenant chacune 100 ng d&#39;ADN matrice, 25 uM de chaque amorce, un tampon approprié, et la polymérase. Réglez le protocole de PCR sur le thermocycleur selon le protocole du fabricant de la polymerase. </li><li> Piscine et quatre réactions PCR nettoyer avec un PCR nettoyer kit selon le protocole du fabricant. Stocker le modèle propre à -20 ° C. </li></ol></li><li> Préparer l&#39;ARN double brin (ARNdb) à partir du modèle en utilisant un kit de transcription de l&#39;ARN de T7, suivant les instructions du fabricant. Attendez ~ concentration 5-15 mg / ml d&#39;ARN double brin. ARNdb stocker à -20 ° C. </li><li> Pour Knockdown Klp61F avec ARNdb, permettent aux cellules S2 exprimant Eg5-mCherry à 25% de confluence à semi-adhèrent au fond d&#39;un plat de culture de tissu de 35 mm pendant 1 heure. </li><li> Retirez le support de la vaisselle et ajouter 5 ug d&#39;ARN double brin contre Klp61F (Drosophila kinésine-5) dilué dans 1 ml de Schneider sans sérum »s médias. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 1 h, puis ajouter 1 ml de médias de Schneider avec 10% de FBS. Incuber les cellules à 25 ° C. </li><li> 24 h après le traitement ARNdb, induire l&#39;expression de Eg5-mCherry en ajoutant CuSO 4 à une concentration finale de 500 uM. Incuber les cellules à 25 ° C pendant encore 24 h. </li></ol> 3. imagerie de cellules vivantes <ol><li> Placez un 22 mm x 22 mm concanavaline A lamelle enrobée dans une boîte de 35 mm de culture de tissu propre. </li><li> Seed 500 pi des cellules qui ont été traitées avec l&#39;ARN double brin et induits O / N sur la concanavaline A lamelle enduit et de leur permettre d&#39;adhérer pendant environ 1 h. </li><li> Assemblez la lamelle dans une chambre de rose (ou navire approprié) pour l&#39;imagerie. </li><li> Trouver les cellules en mitose exprimant à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline. REMARQUE: Les cellules mitotiques exprimant seulement GFP-α-tubuline devrait avoir des fuseaux monopolaires depuis Klp61F, qui est nécessaire pour la bipolarité broche, est renversé 10,13. </li><li> Recueillir images time-lapse de broches bipolaires (par exemple, 1 image par minute) dans les cellules exprimant à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline. </li><li> Alors que l&#39;imagerie, retirez le support de la chambre de rose, et le remplacer par les médias de Schneider contenant 1 uM STLC sur 3 échanges médiatiques consécutives (~ 5 ml au total) dans la chambre de visualiser broche effondrement. </li><li> Au lavage à la drogue et à inverser l&#39;effondrement de la broche, retirez soigneusement le support contenant STLC-de la chambre de rose, et se laver dans le média de Schneider 4x (6-8 ml au total) avant de remplir la chambre de rose une dernière fois avec un milieu frais. Continuer imagerie. </li></ol> 4. Correction d&#39;erreur de dosage <ol><li> Placer un 22 mm x 22 mm concanavaline A lamelles enrobées dans de 35 mm boîtes de culture de tissu de nettoyage. </li><li> Seed 500 pi de cellules qui ont été traitées avec Klp61F ARNdb sur la concanavaline A lamelle enduit et de leur permettre d&#39;adhérer. </li><li> Après que les cellules sont Adhered, ajouter 1,5 ml de médias de Schneider de chaque plat pour amener le volume final à 2 ml. </li><li> Pour arrêter les cellules en mitose, MG132 ajouter à une concentration finale de 10 pM à chacun des plats, et incuber pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 1 uM STLC et incuber pendant 1 heure pour permettre monopôles à se former. </li><li> Laver le STLC par rinçage lamelles 3x avec 2 ml de milieu de Schneider frais à chaque fois. </li><li> Incuber lamelles avec les médias de Schneider, en plus des médicaments pharmacologiques (par exemple, les inhibiteurs de la kinase Aurora) ou du DMSO comme témoin. Remarque: les concentrations d&#39;inhibiteur varient et concentrations finales appropriées doivent être déterminées par l&#39;expérimentateur. Les solutions mères sont généralement faites de telle sorte que l&#39;inhibiteur est dilué à 1: 1000 dans les médias. Dans ce cas, un mélange 1: 1000 dilution de DMSO (ou solvant approprié) sert de commande de véhicule. Nous utilisons l&#39;inhibiteur Aurora B Binucleine 2 à une concentration finale de 40 uM. </li><li> Fixer les cellules à différents points de temps to observer la progression de la formation du fuseau bipolaire et pour évaluer les états de fixation kinétochore. Arranger: <ol><li> Rincer rapidement les lamelles avec 2 ml de 1x BRB-80. </li><li> Fixer les cellules par addition de 2 ml de paraformaldehyde à 10% diluée dans 1 x BRB-80 pendant 10 min. Pipeter soigneusement paraformaldehyde dans une hotte chimique. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 2 ml de 1 x PBS + 1% de Triton-X à 8 min. </li><li> Laver les lames avec 3 x 2 ml de 1 x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Transfert lamelles de cellule côté face vers le haut sur une feuille de Parafilm (utiliser un marqueur pour marquer Parafilm appropriée pour garder la trace des diapositives) dans un plat 150 mm Petri. </li><li> Couvrir les lamelles avec 150 ul bouillie sérum âne (BDS) et incuber à température ambiante pendant 1 heure pour bloquer la liaison d&#39;anticorps non spécifique. Remarque: Ici, le protocole de fixation peut être arrêté pour être poursuivie à un stade ultérieur. Lamelles peuvent être stockés dans une chambre humide à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 24 heures. Pour rendre la chambre de l&#39;humidité, aligner le bord d&#39;un plat de 150 mmavec un laboratoire lingette humide et couvrir avec le plat couvercle Petri. </li><li> Retirer le bloc, et incuber les lamelles pendant 1 heure à température ambiante avec 150 pi d&#39;anticorps primaires dilués de manière appropriée dans BDS à la coloration pendant kinétochores et microtubules à des concentrations finales de 2 pg / ml (ou selon les recommandations du fabricant) et 1 pg / ml, respectivement . Remarque: Ici, le protocole de fixation peut être arrêté pour être poursuivie à un stade ultérieur. Lamelles peuvent être stockés dans une chambre humide à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 24 heures. </li><li> Lavez lamelles de 3x avec 500 pi de PBS 1x + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incuber lamelles pendant 30-60 min à température ambiante avec les anticorps secondaires fluorophores approprié conjugué dilué dans BDS. </li><li> Lavez lamelles de 3x avec 500 pi de PBS 1x + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incuber lamelles avec 150 pi de BDS contenant 1 pg / ml DAPI concentration finale pendant 5 min. </li><li> Laver 2 fois avec des lamelles couvre-1x PBS + 0,1% de Triton-X, et c montageoverslips côté pile sur un «slide 3x1 avec 8 pi de milieu de montage. Peignez les coins avec du vernis à ongles pour immobiliser les lamelles sur des lames. </li></ol></li><li> Cellules d&#39;image avec broches bipolaires qui expriment Eg5-mCherry. Prenez une série Z composée de 30 avions à 0,2 um intervalles dans tous les canaux à l&#39;aide d&#39;un objectif 100X. Analyser soigneusement les kinétochores et microtubules pour déterminer les états de fixation (bi-orientés ou des pièces jointes syntelic). </li></ol>

<ol>
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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Visualisation correction d&#39;erreur est une technique précieuse pour étudier les étapes impliquées dans ce processus cellulaire importante et complexe. Pour ce faire, les pièces jointes erronées sont générées en utilisant des inhibiteurs réversibles, et la correction d&#39;erreur est observée sur lavage de la drogue. Cet essai a été développé à l&#39;origine en utilisant des cellules de culture de tissu de mammifère 5. Cependant, la présence d&#39;un grand nombre de cinétochores dans de nombreux types de cellules de mammifères modèle pose un défi à l&#39;observation des événements individuels de correction d&#39;erreur. Des cellules de Drosophila S2 possèdent aussi peu que 4 paires de cinétochores, ce qui en fait une lignée cellulaire plus préférable pour l&#39;observation de correction d&#39;erreur. Cependant, un inconvénient majeur est que de nombreux inhibiteurs ne sont pas efficaces dans des cellules S2 de Drosophila. Ainsi, la capacité de générer une lignée de cellules de Drosophila S2 humanisé exprimant kinésine-5 humaine constitue un outil précieux pour étudier la correction d&#39;erreur. Bien que les cellules S2 de Drosophila peuvent être unmeilleure lignée cellulaire pour étudier la correction d&#39;erreur, les multiples étapes nécessaires à l&#39;obtention de la lignée cellulaire et abattre des gènes essentiels pose des défis à cette technique. Par exemple, l&#39;efficacité de transfection peut être très faible. Si moins de 20% des cellules expriment la Eg5-mCherry, la transfection doit être répété que le processus de sélection prendra plus de temps. En outre, le pourcentage de cellules exprimant deux protéines fluorescentes peut diminuer au fil du temps. Ceci peut être surmonté en fractionnant des cellules en présence de HCl et la blasticidine S hygromycine B pour sélectionner des cellules exprimant Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline, respectivement. Il est également important de noter que les cellules S2 de Drosophila ont orthologues de nombreuses protéines humaines et; par conséquent, il est essentiel d&#39;optimiser les conditions démontables pour les protéines endogènes. Knockdown conditions optimales peuvent varier de la quantité de l&#39;ARN double brin et la durée du traitement. Considérant l&#39;émergence et l&#39;amélioration rapide de CRISPR-cas9 technologies 15 à 17, la génération d&#39;une lignée de cellules de Drosophila avec le gène remplacé par Klp61F Eg5 humain présente une alternative puissante que permettrait de surmonter les limitations de l&#39;approche et la transfection effet de choc. Notre travail démontre que la mouche à humain remplacement d&#39;un gène doit être une option viable dans ce cas, bien que les réactifs nécessaires pour le faire dans les cellules S2 de drosophile sont actuellement en cours d&#39;élaboration. Ce procédé ne se limite pas à Eg5, mais peut être appliquée pour étudier la fonction d&#39;autres protéines d&#39;intérêt. Si l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs qui ont déjà été mis en place pour être inefficace dans les cellules S2 de drosophile, ce protocole peut être modifié pour étudier l&#39;effet direct des inhibiteurs dans des cellules vivantes, sans crainte des effets hors cible. La lignée cellulaire produit en utilisant ce protocole pourrait également être utilisé dans le criblage à haut débit des analyses pour identifier les médicaments potentiels ciblant les protéines impliquées dans la correction d&#39;erreur.

L&#39;égalité de ségrégation du génome pendant la division cellulaire nécessite des interactions entre l&#39;ADN correctes et broche microtubules répliquées. Microtubules interagissent physiquement avec des chromosomes à travers un ensemble de protéines qui se réunit à centromères connus sous le nom kinetochore 1. La distribution correcte des chromosomes exige que cinétochores sœurs sont bi-orienté, dans lequel chaque sœur est associée à des microtubules provenant opposées pôles du fuseau. Kinetochore microtubules (kt-MT) les pièces jointes qui ne sont pas dans la conformation biorienté sont rapidement et efficacement déstabilisé de fournir l&#39;occasion d&#39;établir biorientation dans un processus connu sous le nom de correction d&#39;erreur. Un essai de correction d&#39;erreur qui a été précédemment mis en place dans des cellules de mammifère 5 nécessite l&#39;assemblage des fuseaux monopolaires utilisant des inhibiteurs de petites molécules contre réversibles Eg5 (kinésine-5). Le traitement de la toxicomanie génère une multitude de pièces jointes syntelic erronées dans lequel botcinétochores h sœurs attachent à la même pôle broche. Un lavage subséquent du médicament permet une visualisation du processus de correction d&#39;erreur. L&#39;essai de correction d&#39;erreur peut être fait en présence d&#39;inhibiteurs de petites molécules ou des passes rabattues pour étudier la contribution des protéines candidates à corriger erronées pièces jointes kt-MT. La capacité à visualiser la correction d&#39;erreurs dans les cellules vivantes est un outil puissant pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans ce processus complexe. Toutefois, le grand nombre de chromosomes présents dans la plupart des lignées de cellules constitue un défi en observant individuelles jointes kt-MT. Des cellules de Drosophila S2, il est idéal pour l&#39;application de l&#39;essai de correction d&#39;erreur, car ils contiennent aussi peu que quatre chromosomes 6, mais de petites molécules inhibitrices de kinésine 5 tels que S-trityl-L-cystéine (STLC) et Monastrol 7-9 ne touchent pas ensemble broche ou kinésine-5 fonction motrice dans les cellules de drosophile. Nous avons donc genresTed une lignée de cellules de Drosophila S2 exprimant kinésine-5 humain sous un promoteur inductible qui est sensible à la kinésine-5 inhibiteurs. Ce protocole décrit comment le knockdown endogène Drosophila kinésine-5 homologue, Klp61F, et en utilisant cette lignée cellulaire dans l&#39;essai de correction d&#39;erreur basé sur des cellules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">Effectine Transfection Reagent</td>
			<td style="width:184px;">Qiagen</td>
			<td style="width:167px;">301425</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F cDNA</td>
			<td style="width:184px;">Drosophila Genomic Resource Center</td>
			<td style="width:167px;">13690</td>
			<td style="width:255px;">Gene Name LD15641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Schneider&#8217;s Media</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">21720-024</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">10082-147</td>
			<td style="width:255px;">Heat Inactivated, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:221px;">Copper (II) Sulfate (CuSO4)</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C8027-500G</td>
			<td style="width:255px;">500mM stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">S-trityl-l-cysteine</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">164739-5G</td>
			<td style="width:255px;">1mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Blasticidin HCl</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">R21001</td>
			<td style="width:255px;">5mg/ml stock in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">10687010</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">T7 Large scale RNA Production System</td>
			<td style="width:184px;">Promega</td>
			<td style="width:167px;">P1320</td>
			<td style="width:255px;">The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F RNAi F primer</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F RNAi R primer</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:184px;">Mo Bio Laboratories, Inc</td>
			<td style="width:167px;">1250</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5275</td>
			<td style="width:255px;">0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">Boiled Donkey Serum</td>
			<td style="width:184px;">Jackson ImmunoResearch Labs</td>
			<td style="width:167px;">017-000-121</td>
			<td style="width:255px;">5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:221px;">Mounting Media</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">20mM Tris pH 8.0,&#160; 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">1x BRB-80</td>
			<td dir="LTR" style="width:184px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:255px;">80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">White Light Source</td>
			<td>Lumencor Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">ET EGFP Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td align="right">49002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">DSRed Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td align="right">49005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">anti-NDC80 antibody&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by the Maresca Lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">DM1&#945; (anti-&#945;-tubulin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">anti-CID antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab10887</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F est nécessaire pour former des broches bipolaires. La kinésine-5 humaine, Eg5, peut sauver la fonction de Klp61F dans des cellules de Drosophila S2 (figure 1A et D). Lors de l&#39;addition de l&#39;inhibiteur de la kinésine-5 (STLC), le niveau de la chute de moteur (Figure 1B et E), et les effondrements de broche associées aux microtubules, ce qui entraîne un monopôle (Figure 1C et F) dans des cellules manquant endogène Klp61F sur l&#39;ARNi réussi (film supplémentaire 1). Il est à noter que les broches bipolaires effondrement lors de l&#39;addition de STLC dans les cellules S2 humanisés kinésine-5 parce que l&#39;activité ne soit pas nécessaire pour maintenir la bipolarité de la broche dans les cellules humaines. Cet écart peut être intéressant en raison de différences de chevauchement et / ou la stabilité des microtubules interpolaire dans les deux systèmes modèles 14. Kinesin-5 inhibition (figure 2A et E) peuvent être Rêve<html> RSED par lavage de la drogue et de la récupération d&#39;un fuseau bipolaire peuvent être suivies au fil du temps. Lors du retrait de l&#39;inhibiteur (figure 2B et F), Eg5-mCherry nouveau associés avec les microtubules comme un bipolaires assemble de broche (figure 2C et G), et les cellules peut évoluer vers une anaphase bipolaire (figure 2D et H, film supplémentaire 2 ). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Figure 1. Ajout de 1 uM STLC conduit à des fuseaux monopolaires dans les cellules S2 de drosophile. Des images représentatives de l&#39;imagerie time-lapse d&#39;une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry (AC) et GFP-α-tubuline (DF) pendant plus de 1 pm STLC. L&#39;inhibiteur Eg5 a été ajouté à 3 min. Barre d&#39;échelle = 5 um. Timestamp = min: sec.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Figure 2. A bipolaires des réformes de la broche lors du retrait de STLC. Des images représentatives de l&#39;imagerie time-lapse d&#39;une cellule de Drosophila exprimant 2 Eg5-mCherry (AD) et GFP-α-tubuline (EH) lors d&#39;une expérience STLC de lavage. STLC a été emporté à 5 min. A bipolaires réformes de broche à moins de 1 h de retirer le STLC. Barre d&#39;échelle = 5 um. Timestamp: min. Sec <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Film supplémentaire 1. (clic droit pour télécharger). Widefield imagerie de fluorescence d&#39;un exemple représentatif d&#39;une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry ( à gauche) et GFP-α-tubuline (à droite). 1 uM STLC a été ajouté à 2 min, et les formes de la broche un monopôle à moins de 10 minutes après l&#39;addition de l&#39;inhibiteur. Les images ont été acquises toutes les 1 mn pris à raison de 10 images par seconde. La barre d&#39;échelle = 5 um. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Film supplémentaire 2. (clic droit pour télécharger).</a> D&#39;imagerie de fluorescence Widefield d&#39;un exemple représentatif d&#39;une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry (à gauche) et GFP-α-tubuline (à droite). Médias contenant 1 uM STLC a été enlevé etrincés à 5 min. A bipolaires réformes de broche à moins de 1 h d&#39;éliminer l&#39;inhibiteur. Les images ont été acquises chaque 1 min et ont joué à une vitesse de 10 images par seconde. Barre d&#39;échelle = 5 um.

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Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Génération d&#39;un «humanisé»<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 Cell Line Sensible à pharmacologique inhibition de Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K vues.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

Vidéo: Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositif microfluidique Dégradé génératrices de biologie cellulaire

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Recherche

Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Les dosages des Saisies en Neurocircuit Mutants épilepsie du Drosophile</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Toxicité cellulaire des Nanogenomedicine dans la lignée cellulaire MCF-7: test MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

L&#39;utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em&gt; Drosophila</em&gt; Folliculo Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Une méthode de quantification sensible et spécifique pour la détermination de sérum myosine cardiaque Binding Protein-C par immuno-Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organite Transport en culture d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Cellules: S2 Cell Line et neurones primaires.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Culture de la drosophile pupes testicule et seul mâle kystes lignée germinale: Dissection, l&#39;imagerie et le traitement pharmacologique

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...