L’objectif global de cette procédure de perfusion de canal pancréatique est de permettre le traçage de la lignée, l’introduction de gènes et le ciblage spécifique de la lignée cellulaire dans le pancréas. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés sur les maladies affectant le pancréas, y compris la pancréatite chronique, le diabète et le cancer du pancréas. Pour commencer, placez une souris anesthésiée sous un microscope à dissection afin que son abdomen soit positionné au centre du champ de vision.
Immobilisez l’animal avec un ruban chirurgical, puis appliquez une pommade ophtalmique sur ses yeux pour les empêcher de sécher. Ensuite, couvrez l’abdomen de la souris avec une épaisse couche de crème dépilatoire. Et après environ trois minutes, essuyez doucement la crème avec de la gaze imbibée d’éthanol à 70% pour enlever tous les poils.
Enfin, essuyez la peau avec de l’éthanol à 70%, suivi d’une solution d’iodure de povidone à 10% pour éliminer tout contaminant et désinfecter la peau. Pour commencer la chirurgie, créez avec un scalpel une incision cutanée médiane s’étendant du processus xiphoïde à l’ombilic. Ensuite, à l’aide de pinces Adson, soulevez le péritoine et faites avec des ciseaux un petit trou médian.
Dilatez la coupe le long de la ligne médiane du péritoine afin que sa longueur soit égale à la longueur de l’incision cutanée. Ensuite, utilisez des rétracteurs contondants pour tirer le foie vers le haut et après avoir exposé le canal biliaire commun, serrez-le avec une pince vasculaire de bouledogue incurvée. Identifiez le duodénum et avec la pince Arruga, retirez-le caudalement pour afficher la papille visible comme une tache blanche sur la surface antérieure de la deuxième partie du duodénum.
Pour identifier le canal pancréatique, retirez le duodénum caudalement, puis positionnez une aiguille de calibre 30-1/5 tangentiellement au duodénum et faites une ponction sur sa paroi qui fait directement face à la papille. Pour infuser la solution, introduisez le cathéter connecté à une pompe à perfusion à travers la duodénotomie créée et faites-le glisser le long du conduit jusqu’à ce qu’il soit visible dans le vaisseau, mais n’atteigne pas plus d’un centimètre pour éviter de contourner les affluents canalaires mineurs. Immobilisez le cathéter en le serrant avec une deuxième pince vasculaire bulldog incurvée.
Allumez ensuite la pompe pour initier l’infusion de 150 microlitres de la solution dans le conduit. Ensuite, injectez au péritoine de la souris environ 1,5 millilitre de solution saline pour éviter toute perte de volume infusé, puis couvrez l’intestin exposé avec une gaze humidifiée pour éviter la dessiccation. Une fois la perfusion terminée, relâchez le cathéter immobilisé et, à l’aide de la pince bulldog, retirez-le doucement du canal pancréatique.
Relâchez ensuite la pince du canal biliaire commun. Fermez le péritoine et la peau en les suturent continuellement en une seule couche et administrez la première des deux doses d’analgésique, dont la seconde sera administrée le lendemain. Ensuite, retournez la souris dans une cage placée sous une lampe chauffante et fournissez à l’animal de la nourriture et de l’eau ad libitum.
Observez la souris jusqu’à ce qu’elle ait retrouvé une conscience suffisante se manifestant par une position sternale. Sept jours après la chirurgie, l’accise du pancréas animal euthanasié ainsi que de la rate, du foie et du duodénum servant de témoins. Immergez l’ensemble des tissus isolés dans une solution de paraformaldéhyde à 4% et fixez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Une fois les tissus fixés, la cryo protège les échantillons en les trempant dans une solution de saccharose à 30% à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après une cryoprotection pendant la nuit, congelez les échantillons dans de l’azote liquide et, à l’aide d’un microtome, coupez des coupes de tissus à six micromètres. Enfin, imagez les sections sous un microscope fluorescent.
Voici des images microscopiques de sections de pancréas excisées de souris sept jours après une chirurgie simulée et une perfusion d’AAV8 portant le gène GFP par canal pancréatique. Le foie, la rate et le duodénum isolés de la souris perfusée avec AAV8 n’ont montré aucun signal GFP tandis que le pancréas a révélé une expression proéminente de GFP, confirmant l’administration spécifique du virus par le pancréas après la perfusion du canal pancréatique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 minutes lorsqu’elle est effectuée correctement.
Lors de cette procédure, il est très important d’effectuer une dissection minutieuse et de faire la duodénotomie la plus petite possible pour l’introduction du cathéter. Après son développement, la technique a ouvert la voie aux chercheurs qui étudient le pancréas pour étudier un certain nombre de pathologies qui affectent l’organe, y compris la pancréatite chronique, le diabète et le cancer du pancréas chez les rongeurs et les modèles animaux plus grands. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’infuser efficacement et sélectivement le canal pancréatique.
