O objetivo geral deste procedimento de infusão de dutos pancreáticos é permitir o rastreamento de linhagem, introdução genética e direcionamento específico da linha celular no pâncreas. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre doenças que afetam o pâncreas, incluindo pancreatite crônica, diabetes e câncer de pâncreas. Para começar, coloque um rato anestesiado sob um microscópio dissecando para que seu abdômen esteja posicionado no centro do campo de visão.
Imobilize o animal com uma fita cirúrgica e, em seguida, aplique uma pomada oftálmica em seus olhos para evitar que ele seque. Em seguida, cubra o abdômen do mouse com uma grossa camada de creme de depilação. E depois de aproximadamente três minutos, limpe suavemente o creme com gaze encharcada em 70% de etanol para remover todos os cabelos.
Por fim, limpe a pele com 70% de etanol, seguida de solução de iodeto de povidone 10% para remover contaminantes e desinfetar a pele. Para começar a cirurgia, crie com um bisturi uma incisão de pele média que se estende do processo xifoide até o umbigo. Em seguida, usando fórceps Adson, levante o peritônio e faça com uma tesoura um pequeno buraco médio.
Expanda o corte ao longo da linha média do peritônio de modo que seu comprimento seja igual ao comprimento da incisão da pele. Em seguida, use retráteis sem cortes para puxar o fígado e depois de expor o ducto biliar comum, fixá-lo com um grampo vascular de buldogue curvo. Identifique o duodeno e com asseps de Arruga, puxe-o para fora caudally para exibir a papila visível como uma mancha branca na superfície anterior da segunda porção do duodeno.
Para identificar o ducto pancreático, retire o duodeno caudally, em seguida, posicione uma agulha de calibre 30-1/5 tangencialmente ao duodeno e faça uma punção em sua parede que diretamente em frente à papila. Para infundir a solução, introduza o cateter conectado a uma bomba de infusão através da duodenotomia criada e deslize-a ao longo do duto até que seja visível dentro do vaso, mas não chegue a mais de um centímetro para evitar contornar pequenos afluentes ductais. Imobilize o cateter fixando-o com um segundo grampo vascular de buldogue curvo.
Em seguida, ligue a bomba para iniciar a infusão de 150 microliters da solução no duto. Em seguida, injete no peritônio do camundongo aproximadamente 1,5 mililitros de soro fisiológico para evitar qualquer perda de volume infundido e, em seguida, cubra o intestino exposto com uma gaze umedecida para evitar a dessecação. Uma vez concluída a infusão, solte o cateter imobilizado e usando o grampo do buldogue, remova-o suavemente do ducto pancreático.
Em seguida, solte o grampo do ducto biliar comum. Feche o peritônio e a pele suturando-os continuamente em uma única camada e administre a primeira das duas doses de analgésico, a segunda será dada no dia seguinte. Em seguida, devolva o rato a uma gaiola posicionada sob uma lâmpada de calor e forneça ao animal comida e água ad libitum.
Observe o rato até que ele recupere consciência suficiente manifestada em recumbência severa. Sete dias após a cirurgia, o consumo do pâncreas animal eutanizado, bem como o baço, fígado e duodeno servindo como controles. Mergulhe todos os tecidos isolados em uma solução de 4% de paraformaldeído e fixe-os a quatro graus Celsius durante a noite.
Uma vez que os tecidos são fixos, crio proteger as amostras, encharcando-as em uma solução de 30% de sacarose a quatro graus Celsius durante a noite. Após uma proteção criogeno durante a noite, congele as amostras em nitrogênio líquido e usando um microtómeo, corte seções de tecido em seis micrômetros. Finalmente, imagem as seções sob um microscópio fluorescente.
Apresentadas aqui estão imagens microscópicas de seções de pâncreas extirpadas de camundongos sete dias após cirurgia falsa e infusão de dutos pancreáticos de AAV8 carregando o gene GFP. Fígado, baço e duodeno isolados do rato infundido com AAV8 não mostraram nenhum sinal de GFP enquanto o pâncreas revelou expressão GFP proeminente, confirmando a entrega específica do pâncreas do vírus após a infusão do ducto pancreático. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 10 minutos quando executada corretamente.
Ao realizar este procedimento, é muito importante realizar dissecção cuidadosa e fazer a menor duodenotomia possível para introdução do cateter. Após seu desenvolvimento, a técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam o pâncreas para investigar uma série de patologias que afligem o órgão, incluindo pancreatite crônica, diabetes e câncer de pâncreas em modelos de roedores e animais maiores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão muito boa de como infundir efetivamente e seletivamente o ducto pancreático.
