Общая цель этой процедуры инфузии протоков поджелудочной железы заключается в том, чтобы обеспечить отслеживание линий, введение генов и нацеливание на клеточную линию в поджелудочной железе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о заболеваниях, влияющих на поджелудочную железу, включая хронический панкреатит, диабет и рак поджелудочной железы. Для начала поместите анестезируемую мышь под рассекающий микроскоп так, чтобы ее брюшко расположило в центре поля зрения.
Обездвижьте животное хирургическим скотчем, а затем нанесите офтальмологическую мазь на его глаза, чтобы предотвратить их высыхание. Далее накройте брюшко мыши толстым слоем крема для удаления волос. И примерно через три минуты аккуратно протрите крем марлей, пропитанной 70% этанолом, чтобы удалить все волосы.
Наконец, протрите кожу 70% этанолом, а затем 10% раствором йодида повидона для удаления любых загрязнений и дезинфекции кожи. Чтобы начать операцию, создайте скальпелем разрез кожи средней линии, простирающийся от кистоидного отроста до пупка. Затем с помощью щипцов Адсона поднимите брюшину и сделайте ножницами небольшое отверстие средней линии.
Разверните разрез вдоль средней линии брюшины так, чтобы его длина была равна длине разреза кожи. Далее используйте тупые втягивающие вещества, чтобы подтянуть печень и после обнажения общего желчного протока зажмите его изогнутым сосудистым зажимом бульдога. Определите двенадцатиперстную кишку и с помощью щипцов Арруга вытащите его каудально, чтобы отобразить сосочек, видимый как белое пятно на передней поверхности второй части двенадцатиперстной кишки.
Чтобы определить проток поджелудочной железы, выведите двенадцатиперстную кишку каудально, затем поместите иглу 30-1/5 калибра по касательной к двенадцатиперстной кишке и сделайте прокол на ее стенке, которая прямо противоположна сосочку. Чтобы влить раствор, вводят катетер, соединенный с инфузионным насосом, через созданную дуоденотомию и скользят им по протоку, пока он не будет виден внутри сосуда, но не достигнет не более одного сантиметра, чтобы избежать обхода второстепенных притоков протоков. Обездвижить катетер, зажав его вторым изогнутым сосудистым зажимом бульдога.
Затем включите насос, чтобы инициировать инфузию 150 микролитров раствора в воздуховод. Затем введите в брюшину мыши примерно 1,5 миллилитра физиологического раствора, чтобы избежать потери объема, а затем накройте открытый кишечник смоченной марлей, чтобы предотвратить высыхание. Как только инфузия будет завершена, отпустите обездвиженный катетер и, используя зажим бульдога, аккуратно удалите его из протока поджелудочной железы.
Затем отпустите зажим из общего желчного протока. Закройте брюшину и кожу, непрерывно нашивая их в один слой и ввести первую из двух доз анальгетика, вторая из которых будет дана на следующий день. Затем верните мышь в клетку, расположенную под тепловой лампой, и обеспечьте животное пищей и водой ad libitum.
Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она не придет в достаточное сознание, проявляющееся в грудине. Через семь дней после операции исключите из усыпленной поджелудочной железы животных, а также селезенки, печени и двенадцатиперстной кишки, выступающих в качестве контроля. Погрузите все изолированные ткани в 4%-ный раствор параформальдегида и зафиксируйте их при четырех градусах Цельсия на ночь.
Как только ткани зафиксированы, крио защищает образцы, замачив их в 30%-ном растворе сахарозы при четырех градусах Цельсия в течение ночи. После ночной криозащиты заморозьте образцы в жидком азоте и, используя микротом, вырежьте участки ткани на шесть микрометров. Наконец, изобразите участки под флуоресцентным микроскопом.
Здесь представлены микроскопические изображения участков поджелудочной железы, иссеканных у мышей через семь дней после фиктивной операции и инфузии протоков поджелудочной железы AAV8, несущего ген GFP. Печень, селезенка и двенадцатиперстная кишка, выделенные у мыши, инфузии AAV8, не показали никакого сигнала GFP, в то время как поджелудочная железа показала заметную экспрессию GFP, подтверждая специфическую для поджелудочной железы доставку вируса после инфузии протоков поджелудочной железы. После освоения эта техника может быть выполнена за 10 минут при правильном выполнении.
При выполнении этой процедуры очень важно выполнить тщательное рассечение и сделать минимально возможную дуоденотомию для введения катетера. После своего развития метод проложил путь для исследователей, изучающих поджелудочную железу, чтобы исследовать ряд патологий, которые поражали орган, включая хронический панкреатит, диабет и рак поджелудочной железы как у грызунов, так и у более крупных животных моделей. После просмотра этого видео вы должны иметь очень хорошее представление о том, как эффективно и избирательно вливать проток поджелудочной железы.
