この膵管注入手順の全体的な目標は、膵臓における系統トレース、遺伝子導入、および細胞株特異的ターゲティングを可能にすることです。この方法は、慢性膵炎、糖尿病、膵臓癌を含む膵臓に影響を与える疾患に関する重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。まず、麻酔をしたマウスを解剖顕微鏡の下に置き、腹部が視野の中心に配置されるようにします。
動物を手術用テープで固定化し、眼科軟膏を目に塗布して乾燥を防ぎます。次に、マウスの腹部を抜毛クリームの厚い層で覆います。約3分後、70%エタノールに浸したガーゼでクリームを軽く拭き取り、すべての髪を取り除きます。
最後に、70%エタノールで皮膚を拭き、続いて10%ポビドネヨウ化溶液を取り除き、皮膚を消毒します。手術を開始するには、シフォイドプロセスから臍に及ぶ正中線皮膚切開をメスで作成します。その後、Adson鉗子を使用して、腹骨を持ち上げ、はさみで小さな正中の穴を作ります。
腹骨の正中線に沿ってカットを展開し、その長さが皮膚切開の長さに等しくなるようにします。次に、鈍いレトラクタを使用して肝臓を引き上げ、一般的な胆管を露出させた後、湾曲したブルドッグの血管クランプでクランプします。十二指腸を識別し、アルガ鉗子で、十二指腸の第2部分の前表面に白い斑点として見える乳頭を表示するために、それを大胆に引き出します。
膵管を識別するには、十二指腸を尾指尾から引き出し、30-1/5ゲージの針を十二指腸に正接的に配置し、乳頭の真向かいにある壁に穿刺を行います。溶液を注入するには、作成された十二指腸切除術を通して注入ポンプに接続されたカテーテルを導入し、それが容器内に見えるまでダクトに沿ってそれをスライドさせるが、マイナーな管支線をバイパスしないように1センチメートル以上に達しない。2つ目の湾曲したブルドッグの血管クランプでカテーテルを固定します。
次にポンプをオンにして、150マイクロリットルの溶液をダクトに注入します。次に、注入された体積の損失を避けるために生理食塩水の約1.5ミリリットルのマウスの腹膜に注入し、乾燥を防ぐために湿らせたガーゼで露出した腸を覆う。注入が完了したら、固定化されたカテーテルを解放し、ブルドッグクランプを使用して、膵管からそっと取り出します。
次に、共通の胆管からクランプを解放します。腹膜と皮膚を単層で連続的に縫合して閉じ、2回の鎮痛剤のうちの最初の用量を投与し、そのうちの2回目は翌日に与えられる。その後、ヒートランプの下に置いたケージにマウスを戻し、食べ物と水のアドリビタムを動物に提供します。
胸骨の不通に現れる十分な意識を取り戻すまで、マウスを観察する。手術の7日後、安楽死させた動物膵臓からの切除、脾臓、肝臓、十二指腸がコントロールとして機能する。4%パラホルムアルデヒド溶液に全ての分離組織を浸し、一晩摂氏4度で固定します。
組織が固定されたら、クライオは一晩摂氏4度で30%スクロース溶液に浸してサンプルを保護します。一晩のクライオ保護の後、液体窒素でサンプルを凍結し、ミクロトームを使用して、6マイクロメートルで組織切片を切断します。最後に、蛍光顕微鏡下で切片を画像化します。
ここでは、GFP遺伝子を運ぶAAV8の恥手術と膵管注入の7日後にマウスから切除された膵臓切片の顕微鏡画像です。AAV8を注入したマウスから分離した肝臓、脾臓、十二指腸はGFPシグナルを示さなかったが、膵臓は顕著なGFP発現を明らかにし、膵管注入後のウイルスの膵臓特異的送達を確認した。一度習得すると、この技術は、適切に実行すると10分で行うことができます。
この手順を実行している間、慎重に解剖を行い、カテーテルの導入のために可能な限り小さな十二指腸切除術を行うことが非常に重要です。その開発後、この技術は、膵臓を研究している研究者が、げっ歯類とより大きな動物モデルの両方で慢性膵炎、糖尿病、膵臓癌を含む臓器を苦しめる多くの病理を調査する道を開いた。このビデオを見た後、あなたは効果的かつ選択的に膵管を注入する方法の非常に良い理解を持っている必要があります。
