L’objectif de cette procédure est de fournir des conseils pour la production, la cristallisation et la détermination structurelle de l’IKK1-alpha humain afin de comprendre la base mécaniste de sa fonction de signalisation et d’établir des plates-formes pour la conception rationnelle des médicaments. Cette méthode devrait aider les chercheurs à déterminer la structure de l’IKK1, qui fournirait des réponses aux questions clés dans le domaine de la signalisation immunitaire. Cette technique décrit un chemin rationalisé vers l’obtention de cristaux de protéines IKK, qui sont plutôt réfractaires à la cristallisation et de fournir diverses informations critiques pour surmonter les goulets d’étranglement dans la détermination des structures.
En général, les individus nouveaux à cette méthode auront du mal, parce que la génération de quantités milligrammes de protéines solubles et bien comportées, nécessite son expression dans les cellules d’insectes, et la cristallisation peut être faite dans seulement une fenêtre très étroite de conditions. La procédure de remplacement moléculaire utilisée pour déterminer la structure d’IKK1 peut également être très délicate, en particulier en raison d’une mauvaise propriété de déflexion des cristaux, et non à l’emplacement de l’unité asymétrique contenant de nombreuses molécules IKK1 en l’absence de modèles de recherche appropriés. Kyle Shumate et Sonjiala Hotchkiss, étudiants de mon laboratoire, démontreront les procédures.
Le premier jour, plaquez les cellules Sf9 en deux millilitres de milieu de cellules d’insectes Sf903, dans chaque puits d’une plaque de six puits et incubez à 27 degrés Celsius. Passer les cellules quand ils atteignent une densité de deux à trois fois 10 à la six cellules par millilitre en suspension en le diluant à des médias frais, à une densité d’environ six fois 10 à la cinq. Le deuxième jour, diluer huit microlitres de réaccente de transfection Sf9 dans 100 microlitres de SF-903 ou grace’s Insect Medium.
Puis vortex le mélange brièvement. Dans un tube séparé, diluer un microgramme de bacmid recombinant purifié en kit dans 100 microlitres du même milieu. Mélanger l’ADN dilué et le réaccente de transfection.
Après avoir couver à température ambiante de 15 à 30 minutes, retirer le milieu du puits. Ajouter ensuite un millilitre de milieu frais. Ensuite, ajoutez le mélange de réavant de transfection d’ADN dilué sur les cellules, en ajustant la taille de la goutte de telle sorte qu’il ne déloge pas les cellules adhérentes.
Après six heures, ajouter 1,5 millilitres de milieu frais sur le dessus des cellules. Incuber les cellules à 27 degrés Celsius, en vérifiant périodiquement les puits toutes les 12 heures pour déceler les signes d’infection virale. Le cinquième jour, retirer le milieu contenant des cellules, 60 à 72 heures après l’infection.
Après avoir transféré le milieu dans des tubes, centrifugeuse pendant cinq minutes à 500 fois g et quatre degrés Celsius. Une fois terminé, enregistrer le supernatant, qui est la pile de virus P1. Le premier jour, resuspendez la pastille cellulaire His-IKK1 précédemment préparée dans 40 millilitres de tampon de lyse.
Placez la suspension cellulaire sur la glace et lysez les cellules par sonication à des cycles de service de 60 % à 70 % et de cinq à dix impulsions d’une durée de 30 secondes à un intervalle supérieur à une minute. Clarifier le lysate par centrifugation à plus ou égal à 28 000 g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir préparé une résine Nickel-NTA Agarose, selon le protocole du texte, élisez la protéine alpha IKK1 étiquetée His sous flux gravitationnel à l’aide de 20 millilitres de tampon d’élitution.
Recueillir une à 1,5 millilitre fractions. Après avoir combiné les fractions contenant la protéine, digérer l’échantillon avec la protéase TEV pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le matin du deuxième jour, incuber la protéine avec un millimolaire d’ATP, en présence de chlorure de magnésium, bêta-glycérophosphate, fluorure de sodium et orthovanadate de sodium pendant une heure à 27 degrés Celsius.
Après l’incubation, filtrer la solution protéique à l’aide d’un filtre de 0,45 micron. Chargez ensuite environ six millilitres de l’échantillon sur une colonne d’exclusion de taille préparative de 120 millilitres, fixée à un système automatisé de chromatographie liquide. Après l’équilibrage, exécutez la chromatographie d’exclusion de taille à un débit d’un millilitre par minute et recueillez des fractions de deux millilitres.
Pendant la course, surveiller l’éution à 280 et 254 nanomètres. Après avoir tiré les fractions pures, concentrez-vous dans un concentrateur centrifuge de 30 kilodaltons et moléculaire, suivant les instructions du fabricant. Distribuez ensuite des aliquots de 25 microlitres de la protéine concentrée et clignotez dans de l’azote liquide.
À l’aide d’un robot, pipette 80 à 100 microlitres d’un reagent de cristallisation dans le réservoir d’une plaque de 96 puits. À l’aide d’un robot de cristallisation, distribuez et mélangez de 0,2 à 0,25 microlitres d’IKK1 et de son complexe inhibiteur avec le même volume de solution de réservoir. Immédiatement après avoir mis les gouttes, sceller chaque plaque avec des films optiquement clairs pour éviter l’évaporation.
Incuber une assiette à 18 degrés Celsius et l’autre plaque à quatre degrés Celsius dans une pièce froide. Utilisez un microscope stéréo avec un polariseur pour vérifier l’apparence du cristal dans chaque goutte, tous les jours, pendant les sept premiers jours, puis à des intervalles plus longs. Après avoir préparé IKK1 et son complexe inhibiteur comme décrit précédemment, transférez les solutions de puits à chaque puits d’une plaque de 24 puits.
Placez un à 1,5 microlitres de solution de puits sur un couvercle en verre propre. Ajouter un volume égal d’IKK1 et son complexe inhibiteur à la couverture en verre et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas trois à quatre fois. Après avoir appliqué de la graisse sur les anneaux de chaque puits de la plaque, retourner le couvercle en verre et placer sur le puits respectif avec des forceps.
Sceller ensuite le puits en appuyant sur le couvercle en verre. Après avoir mis en place toutes les gouttes dans la plaque de 24 puits, incuber dans la chambre froide, dans l’obscurité. Vérifiez occasionnellement les gouttes au microscope pour l’apparence et la croissance des cristaux.
Une fois la croissance du cristal terminée, retirez doucement le couvercle en verre contenant le cristal et placez-le sur une surface solide avec la goutte de cristal orientée vers le haut. Ajouter délicatement 10 microlitres de cryo A solution sur le dessus de la goutte et mélanger délicatement par pipetting de sorte que le cristal n’est pas touché. À l’aide d’un microscope, retirer lentement un peu de liquide du cristal et conserver environ cinq à huit microlitres de la solution.
Ajouter délicatement 2,5 à quatre microlitres de solution cryo B sur la goutte et mélanger délicatement par pipetting. Couvrir le couvercle en verre d’une petite boîte de Pétrie pour éviter le flux d’air direct sur le cristal. Après avoir attendu cinq minutes, choisissez soigneusement un seul cristal de la goutte dans un cryoloop approprié monté sur une base appropriée.
Congeler le cristal dans de l’azote liquide. Rangez ensuite le cristal contenant du cryoloop dans une rondelle immergée dans de l’azote liquide dans un flacon Dewar jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la diffraction des rayons X au synchrotron. Après des essais approfondis avec plusieurs variantes IKK1 différentes, des cristaux ont été obtenus avec une construction tronquée, qui a montré des propriétés appropriées de rayon X seulement en présence de l’inhibiteur d’IKK XII.
L’effet combiné des données de rayons X à basse résolution avec des intensités faibles, un grand nombre de molécules IKK1 dans l’unité asymétrique et la variation conformationnelle du modèle monomérique-dimérique IKK1, par rapport aux modèles IKK2 connus, ont rendu difficile l’obtention d’une solution de remplacement moléculaire, IKK1, et de déterminer sa structure. Différentes structures IKK2 indiquaient une orientation inter-monomère différente dans ses dimers de sorte que la distance entre les carbones alpha de P578 dans les deux domaines de kinase, dans quatre modèles différents de dimère, variait entre 39 et 61 angstroms. L’obtention d’un modèle de recherche utile a été possible grâce à la carte de microscopie cryoélectron à basse résolution et à un modèle de haute précision des domaines IKK1 qui pourraient être générés sur la base d’une structure IKK2 haute résolution.
Le modèle initial indiquait une orientation du domaine kinase pivotant de 24 degrés par rapport à celle d’un monomère IKK2 et d’une ouverture n-terminale de 58 angstroms. En utilisant l’un des dimers avec l’ouverture de 52 angstrom comme modèle, six dimers dans l’unité asymétrique ont été localisés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en quelques mois, si elle est exécutée correctement.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que l’obtention d’une protéine soluble, active et bien comportée est la première étape critique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension générale de toutes les étapes qui doivent être suivies dans les moindres détails, pour réussir à cristalliser et à déterminer la structure de la protéine IKK1. En apprenant cette procédure, il existe encore des structures d’autres protéines de la famille IKK qui peuvent également être déterminées afin de répondre à d’autres questions sur la signalisation kinase-mitogène.
