Cette publication a été financée par la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et l’innovation des programmes en vertu de la Convention de subvention de Marie Sklodowska-Curie aucun 642893 (IMPRESS), le Bureau de coût (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) et le Centre d’Excellence en recherche- 1476-4/2016/FEKUT.

Toutes les procédures permettant de travailler avec des anguilles européennes décrites dans le présent protocole a étaient approuvés par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale à l’Universitat Politècnica de València, suivant les lois espagnoles et règlements contrôlant les expériences et procédures sur les animaux vivants.
1. Maintenance de poisson
<ol><li>Porter les anguilles européennes à un centre de recherche et les mettre dans un aquarium de 200 L avec un système de recirculation. Utiliser des thermostats et des glacières pour maintenir une température constante de 20 ° C.</li>
	<li>Garder le poisson dans l’obscurité afin d’éviter le stress22 et sans nourriture pendant l’expérience.</li>
	<li>Garder le poisson dans l’eau douce pendant les 3 premiers jours. Ensuite changez 1/3 de l’eau et remplir avec de l’eau de mer tous les deux jours jusqu'à arriver à une salinité de 37,0 ± 0,3 g/L.</li>
</ol>2. hormonothérapie
Remarque : Le traitement hormonal consiste en des injections hebdomadaires de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) pendant toute la durée (neuf semaines) de l’expérience.
<ol><li>Préparer l’hormone hCG à l’avance à une concentration de 1 IU/µL en diluant l’hormone dans du sérum physiologique (0,9 % NaCl). Remarque : L’hormone peut être préservée dilué à cette concentration pendant plus d’une semaine à-18 ° C.</li>
	<li>Pour anesthésier les poissons, préparer un seau flexible de 40 L avec 5 L d’eau du système.<ol>
<li>Dans un ballon jaugé de 250 mL, diluer 300 mg de benzocaïne dans 100 mL d’éthanol à 70 %.</li>
		<li>Versez la benzocaïne diluée dans le seau (concentration finale 0,36 mM) et mélanger bien. Il s’agit pour une concentration finale de benzocaïne de 60 mg/L.</li>
		<li>Transférer le poisson, individuellement, dans l’eau avec la benzocaïne et attendez quelques secondes jusqu'à ce que la benzocaïne prend effet et le poisson est correctement anesthésié. Remarque : Pour confirmer que le poisson est anesthésié, placer le poisson dans une position en décubitus dorsal et vérifier qu’il reste toujours dans cette position.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour administrer l’hormone, peser le poisson et préparer l’hormone hCG à une dose de 1,5 UI/g de poisson, dans un tube en plastique de 1,5 mL.<ol>
<li>Remplissez une seringue de 1 mL avec l’hormone hCG dans le tube en plastique.</li>
		<li>Placez les poissons anesthésiés en décubitus dorsal et avec l’aide ou la seringue, injecter de l’hormone soigneusement dans la zone intrapéritonéale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retourner le poisson à l’aquarium et surveiller jusqu'à ce que complètement guéri. NOTE : L’administration hormonale doit être effectué chaque semaine pendant toute l’expérience. Normalement, les anguilles européennes commencent spermating après 6-7 semaines de traitement hormonal.</li>
</ol>3. prélèvement de sperme
<ol><li>Pour obtenir les meilleurs échantillons de qualité, extrait sperme 24 h après l’administration hormonale6,23.</li>
	<li>Anesthésier les poissons avec la benzocaïne comme décrit dans l’étape 2.2.</li>
	<li>Placez les poissons anesthésiés en décubitus dorsal, nettoyer les parties génitales avec une giclée d’eau distillée et sécher soigneusement avec du papier, pour éviter la contamination de fèces présente dans la région génitale ou l’activation accidentelle de sperme par le contact avec l’eau de mer de l’aquarium.</li>
	<li>Placer les doigts sur les deux côtés latérale du poisson, massez soigneusement appuyant latéralement de ses nageoires pectorales à la région génitale pour forcer le sperme sortir.<ol>
<li>Répéter le massage jusqu'à ce qu’aucuns plus de sperme ne sort de l’ouverture génitale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir le sperme dans des tubes en plastique 15 mL à l’aide d’une pompe à vide.</li>
	<li>Diluer le sperme extrait 01:10 mis à jour le Tanaka´s extender solution24 (137 mM NaCl, 76,2 mM NaHCO3, dans l’eau distillée) à 4 ºC. Remarque : Le sperme dans la solution d’extension devrait être maintenu à 4 ºC.</li>
</ol>4. évaluation de la qualité de sperme
<ol><li>Préparer l’eau de mer artificielle13 (en mM : NaCl 354,7, MgCl2 52,4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28.2, KCl 9.4, dans l’eau distillée) avec 2 % sérum d’albumine bovine (BSA) (filtrantes), ajuster le pH à 8,2, osmolalité à 1100 mOsm/kg et de maintenir Il est à 4 ° c pour éviter la croissance bactérienne.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel pour l’analyse du sperme assistée par ordinateur (CASA) et sélectionnez le module de sperme du poisson.<ol>
<li>Cliquez sur Propriétés pour ouvrir la configuration du logiciel du système. Là, définissez les options de capture à 60 images par seconde. Optique de phase négative Select, Makler chambre et échelle de X 10.</li>
		<li>Sélectionnez ensuite les valeurs de l’analyse, poisson comme espèce et zone de particules plus grand que 2 µm2 et inférieure à 20 µm2.</li>
		<li>Sur les paramètres de la vitesse, la valeur lente lorsque les cellules se déplacent entre 10 et 45 µm/s, défini sur moyen lors du déplacement entre 45 et 100 µm/s et valeur rapide lors d’un déplacement plus rapide que 100 µm/s. Remarque : Les spermatozoïdes d’une vitesse plus lente que 10 µm/s étaient considérés comme immobiles.</li>
		<li>Sélectionnez les valeurs progressistes que 80 % de la rectitude (STR) et enregistrer les propriétés.</li>
		<li>Cliquez sur le Champ de Capture (une fenêtre avec les images en direct de la caméra s’ouvrira). Remarque : Le système d’analyse de sperme assistée par ordinateur est formé par un microscope, une caméra et un logiciel d’analyse image.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le comptage de la chambre, mettre 4 µL d’eau de mer artificielle et ajouter 0,5 µL de solution de sperme (spermatozoïdes dilués dans la solution d’extension).<ol>
<li>Mettre l’image au microscope au grossissement de 10 X dans la phase négative. 15 s après l’activation, cliquez sur Capture - à partir de vidéo dans le logiciel d’analyse de sperme assistée par ordinateur.</li>
		<li>Analyser tous les échantillons dans des échantillons en triple et sélectionnez une mobilité supérieure à 70 % pour la cryoconservation. Remarque : Il est très important de sélectionner seulement qualité de sperme pour la réussite de ce protocole de cryoconservation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. méthode de congélation de sperme
<ol><li>Se préparer à l’azote liquide à l’avance (environ 2.5 L) dans un 34 x 34 cm x 30 cm et la boîte de styromousse épaisseur 5 cm. Remarque : Maintenir un niveau d’azote liquide de 4-5 cm de hauteur en tout temps.<ol>
<li>Construire une structure flottante pour les congeler le sperme. Utiliser 2 morceaux de polystyrène (20 cm x 5 cm), liez-les avec 2 tubes en plastique et la structure sur l’azote liquide. Cette structure doit flotter au-dessus de l’azote liquide à une hauteur approximative de 3 cm sur toute la surface (Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56835/56835fig1.jpg"> Figure 1 . Schéma de la structure flottante utilisée pour la pré congélation dans l’azote liquide. La structure se compose de deux pièces de faible densité de mousse de polystyrène de 20 cm x 4 cm x 5 cm, reliées par des tubes en plastique de 14 cm. Les paillettes sont placés sur les tubes en plastique à 3 cm au-dessus de l’azote liquide. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56835/56835fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="2"><li>Préparer la solution de cryoconservation par le mélange de sperme, de la solution d’extension et de méthanol au ratio de 1:8:1 en plastique de 1,5 mL tubes et mélanger doucement.</li>
	<li>Avec l’aide d’une pipette, ajouter 480 µL de la solution de cryoconservation dans les 500 pailles µL et si nécessaire, marquez-les en fermant une extrémité avec la pâte à modeler.</li>
	<li>Mettre la paille sur le dispositif flottant à une hauteur de 3 cm au-dessus de l’azote liquide pendant 3 min. Ensuite, placer la paille dans l’azote liquide.</li>
	<li>Après 10-15 min, transférer les pailles dans un réservoir de stockage d’azote liquide à l’aide de longues pinces et gardez-les immergées dans l’azote liquide à tout moment. Ici, les spermatozoïdes peuvent être conservés indéfiniment.</li>
</ol>6. méthode de décongélation
<ol><li>Préparez une boîte de mousse de polystyrène à l’azote liquide comme indiqué au point 5.1 et préparez un bain d’eau à l’aide d’un bécher 3 L d’eau du robinet à 40 ºC.</li>
	<li>Transférer les paillettes de sperme congelé de la cuve de stockage dans la boîte de styromousse à l’azote liquide à l’aide de longues pinces.<ol>
<li>Mettre chaque paille dans un bain d’eau à 40 ° c pendant 13 s.</li>
		<li>Verser le sperme dans un tube en plastique de 1,5 mL en coupant l’extrémité fermée de la paille avec des ciseaux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser la motilité des spermatozoïdes à l’aide de système d’analyse de sperme assistée par ordinateur, comme expliqué dans le point 4.1.</li>
	<li>Gardez 100 µL de sperme pour analyser la viabilité des spermatozoïdes avec un cytomètre en flux.</li>
</ol>7. cytométrie en flux
<ol><li>Utiliser un kit fluorescent contenant de l’iodure de propidium (PI), qui est un composé fluorescent rouge qui taches les noyaux des cellules mortes et un membrane perméable composé fluorescent nucléaire, que les taches de vert les noyaux des cellules vivantes.<ol>
<li>Préparer la solution de coloration verte fluorescente en diluant il de la solution mère (1 mM) 01:10 dans un milieu Tanaka´s à une solution de travail de 100 µM.</li>
		<li>Ne pas diluer la solution PI. La solution est à 2,4 mM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour chaque échantillon, prendre 50 µL de sperme frais ou dégelés et ajouter 0,5 µL de vert fluorescent, la coloration de la solution de travail (concentration finale 1 µM) et 2 µL de solution de PI (concentration finale 100 µM).</li>
	<li>Incuber les échantillons contenant des colorants (PI et une coloration fluorescente verte) dans l’obscurité pendant 5 min.<ol>
<li>Diluer les échantillons dans 500 µL de solution d’extension Tanaka´s et d’analyser avec le cytomètre en flux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allumez le cytomètre en flux et créer un nouveau protocole contenant au moins 2 parcelles : SS log log vs FS et FL1 vs FL3. Remarque : Les deux, vert fluorescent iodure de propidium et de coloration peut être excitée avec la lumière de longueur d’onde visible. Lorsqu’elle est liée à l’ADN, l’émission de fluorescence maximale de ces colorants sont 516 nm et 617 nm, respectivement.<ol>
<li>Ajuster la tension des différents lasers : SS = 199 ; FS = 199 ; LV1 = 377 ; LV3 = 372</li>
		<li>Mettre en place l’accord de réglages d’acquisition aux événements maximales = 5000 ou 15 s (la concentration finale de l’échantillon devrait être environ 1 million de cellules/mL). Lire l’échantillon à l’aide d’un faible débit.</li>
		<li>Sélectionnez le mode de lecture tube unique mode de position fixé.</li>
		<li>Placer l’échantillon dans le bon numéro du carrousel</li>
		<li>Lire l’échantillon (en appuyant sur F9) et conserver les données collectées dans un fichier excel (en appuyant sur F7) pour une analyse ultérieure.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>ICES_Working_Group_on_Eels. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).</li><li>Moriarty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Catches+of+Elver+of+1928-1988.">European Catches of Elver of 1928-1988.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).</li><li>Dekker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+geometry+of+the+European+eel+stock.">The fractal geometry of the European eel stock.</a> ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).</li><li>Jacoby, D., Gollock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hCG+as+spermiation+inducer+on+European+eel+semen+quality.">Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality.</a> Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).</li><li>P&#233;rez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+and+spermiation+in+the+male+European+eel:+assessment+of+sperm+quality+throughout+treatment.">Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment.</a> J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+effects+of+thermal+regime+and+alternative+hormonal+treatments+on+the+reproductive+performance+of+European+eel+males+(Anguilla+anguilla)+during+induced+sexual+maturation.">Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation.</a> Aquaculture. 354, 7-16 (2012).</li><li>Asturiano, J. F., S&#248;rensen, S. R., P&#233;rez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Production+of+Larvae+Using+Cryopreserved+Sperm:+Effects+of+Preservation+Temperature+and+Cryopreservation+on+European+Eel+Sperm+Fertilization+Capacity.">First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity.</a> Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).</li><li>Di Biase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-treatment+with+androgens+during+artificial+induction+of+maturation+in+female+eel,+Anguilla+anguilla:+Effects+on+egg+production+and+early+development.">Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development.</a> Aquaculture. 479, 508-515 (2017).</li><li>Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+in+female+silver+eels,+Anguilla+australis:+The+benefits+of+androgen+pre-treatment.">Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment.</a> Aquaculture. 437, 111-119 (2015).</li><li>Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+manipulations+for+the+enhancement+of+sperm+production+in+cultured+fish+and+evaluation+of+sperm+quality.">Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality.</a> Aquaculture. , (2016).</li><li>Ohta, H., Izawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diluent+for+cool+storage+of+the+Japanese+eel+(Anguilla+japonica)+spermatozoa.">Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa.</a> Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Eel+Sperm+Diluent+for+Short-term+Storage.">European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage.</a> Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).</li><li>Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+by+the+environmental+concentration+of+ions+of+the+potential+for+motility+in+Japanese+eel+spermatozoa.">Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa.</a> Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm.">Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physio-chemical+characteristics+of+seminal+plasma+and+development+of+media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+sperm.">Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).</li><li>Szab&#243;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm+using+different+extenders+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants.</a> Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sperm+of+farmed+European+eel+Anguilla+anguilla.">Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla.</a> J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., P&#233;rez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+European+eel+sperm+cryopreservation+method+by+preventing+spermatozoa+movement+activation+caused+by+cryoprotectants.">Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants.</a> Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).</li><li>Marco-Jim&#233;nez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+spermatozoa:+effect+of+dilution+ratio,+foetal+bovine+serum+supplementation,+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants.</a> Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sperm+cryopreservation+on+the+European+eel+sperm+viability+and+spermatozoa+morphology.">Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology.</a> Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).</li><li>Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Sexual+Maturation+in+Wild+Female+European+Eels+(Anguilla+anguilla)+in+Darkness+and+Light.">Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light.</a> Isr. J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-assisted+sperm+analysis+(CASA)+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish.">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).</li><li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+sperm+motility+and+factors+affecting+sperm+quality+in+cultured+fish.">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).</li><li>Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice.">Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).</li><li>Magnotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+vitrification+of+fish+semen:+a+review+with+special+emphasis+on+marine+species.">Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species.</a> Rev. Aquacult. , (2016).</li><li>Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domaga&#322;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-thawed+motility+and+fertility+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar+L.)+sperm+frozen+with+four+cryodiluents+in+straws+or+pellets.">Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets.</a> Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).</li><li>Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitable+methods+for+cryopreservation+of+semen+from+Atlantic+halibut,+Hippoglossus+hippoglossus+L.">Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L.</a> Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+eel+(Anguilla+japonica+Temminck+&amp;+Schlegel,+1846)+propagation+using+cryopreserved+sperm+samples.">Japanese eel (Anguilla japonica Temminck &amp; Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples.</a> J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Ce protocole décrit le processus complet pour la cryoconservation de maturation, de manutention et de sperme anguille européenne. Les conditions d’élevage décrites ici sont optimales pour la maturation rapide et de la production de grands volumes de sperme de qualité dans cette espèce de7, 6,25. Le succès de ce protocole de cryoconservation et son utilisation possible pour la fécondation après décongélation dépend ...

Au cours des 25 dernières années, le nombre d’anguille européenne (Anguilla anguilla) arrivant sur les côtes européennes ont diminué régulièrement par 90 % 1,2,3. Il y a plusieurs facteurs qui expliquent cette baisse drastique, notamment la pollution, les infections, destruction d’habitat et de la surpêche. Tout cela a eu un effet profond sur cette espèce, conduisant à l’inscription de l’anguille européenne à l’Union internationale pour la liste de la Conservation de la Nature (UICN) comme en danger critique 4. Par conséquent, le développement des techniques et des protocoles pour la reproduction en captivité sont nécessaires.
La maturation de l’anguille européenne en captivité est obtenue par un traitement hormonal 5,6,7 , mais la production de gamètes chez les deux sexes est difficile à synchroniser 8. Même si le développement de nouveaux implants d’androgènes a montré pour accélérer l’ovogenèse chez les anguilles 9,10, le moment de la maturation finale chez les femmes est encore très variable et difficile à contrôler 11. Stockage à court terme de sperme 12,13,14 cryopreservation techniques et sont donc nécessaires pour gestion de reproduction, faire des gamètes synchronisation inutile 8.
Cryoconservation du sperme de l’anguille européenne a été développée depuis 2003 15,16. Plusieurs chercheurs ont conçu réussies protocoles utilisant le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou méthanol comme cryoprotecteurs 16,17,18,19,20. Bien que les deux protocoles ont été utilisées avec succès, la viabilité des cellules obtenues de sperme décongelé cryopréservé avec le DMSO est inférieure avec méthanol 20,21. En outre, sperme anguille est activée au contact de DMSO et exige plus fastidieux de manipulation de sperme 19, donc le méthanol est un cryoprotecteur plus adapté pour les spermatozoïdes de l’anguille européenne de DMSO.
Ici, le protocole de manipulation optimale et un traitement hormonal de l’anguille européenne est décrites ci-dessous. En outre, le meilleur protocole de cryoconservation de sperme anguille européenne à l’aide de méthanol comme un cryoprotecteur et un protocole pour l’évaluation de la qualité du sperme chez cette espèce seront également décrit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:151px;">AQUACEN BENZOCA&#205;NA +D2A2:D24</td>
			<td style="width:128px;">AQUACEN</td>
			<td style="width:119px;">3394ESP</td>
			<td style="width:141px;">Benzocaine</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>3624-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>305501</td>
			<td>Syringe 1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FC500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Air pump 100</td>
			<td>EHEIM</td>
			<td>4011708370032</td>
			<td>Modified for suction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Eppendorf 1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>175508</td>
			<td>Plastic tubes 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>175747</td>
			<td>Plastic tubes 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flexible bucket</td>
			<td>Fiel</td>
			<td>1040101</td>
			<td>40 L, Black color.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ethanol</td>
			<td>Guinama SL</td>
			<td>Mg96270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyopreservation straws&#160;</td>
			<td>IMV Technologies</td>
			<td>14550</td>
			<td>500 &#181;L straws</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Live/Dead Sperm Viability Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7011</td>
			<td>Cytometer Kit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Modelling clay</td>
			<td>JOVI</td>
			<td>Art 30</td>
			<td>4 different colors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Precision scale PCB</td>
			<td>KERN &#38; Sohn GmbH</td>
			<td>PCB35002</td>
			<td>Digital scale</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saline solution Vitulia 0.9%</td>
			<td>Laboratorios Ern, S.A.</td>
			<td>C.N. 999790.8</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Forceps</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3710025</td>
			<td>30 cm metal forceps</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Scissors</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3700014</td>
			<td>Scissors 14cm</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ovitrelle (r-hCG)</td>
			<td>Merck SL</td>
			<td>EMEA/H/C/000320</td>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>2112211210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2SO4</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>3257091611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaHCO3</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>1416381210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">782M Camera</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>782M</td>
			<td>Camera for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ISAS v1</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>ISAS v1</td>
			<td>CASA software</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SpermTrack-10</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>SpermTrack-10</td>
			<td>Countig chamber for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Beaker Pyrex 3L</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>2110668</td>
			<td>Glass beaker 3L</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flask Pyrex 250 GL-45</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>21801365</td>
			<td>Glass flask 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>PO02000500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Methanol</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>ME03061000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>MA00370500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05482</td>
			<td>Bovine serum albumina</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Styrofoam box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34x34x30 cm and 5cm thick</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and treatment of male european eels (anguilla anguilla) for hormonal maturation and sperm cryopreservation

Au cours des dernières années, plusieurs groupes de recherche ont travaillé sur le développement et l’amélioration de nouveaux protocoles pour la manipulation de l’anguille européenne et de la maturation. En encore, des injections hebdomadaires de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) sont sont révélés maturate mâles après seulement 5-6 semaines de traitement, produire des volumes élevés de qualité de sperme pendant plusieurs semaines. En outre, protocoles de cryoconservation de sperme en utilisant différentes matières de charge, cryoprotecteurs et refroidissement et dégels ont été décrits précédemment pour l’anguille européenne. Ici, nous montrons que Tanaka´s la solution d’extension peut être directement utilisée pour la fertilisation ou pour la cryoconservation, ce qui rend inutile l’utilisation de différents types de solutions et dilutions. En outre, l’utilisation du méthanol comme un cryoprotecteur, ce protocole facile à utiliser comme méthanol a une toxicité faible et ne s’active pas le sperme. Le sperme n’a pas à être cryoconservés immédiatement après l’ajout de la cryoprotecteur, et il peut être utilisé longtemps après être décongelés. En outre, la motilité des spermatozoïdes est encore élevée après décongélation même s’il est inférieur à celui du sperme frais. Le but de ce travail est de montrer le meilleur protocole disponible pour l’anguille européenne, une maturation et une cryoconservation de sperme.

Sperme de 18 anguilles avec une motilité des spermatozoïdes de 70 % ou plus, a été choisie pour cette étude. Les résultats ont montré une réduction de tous les paramètres de qualité après que décongélation par rapport à ceux de sperme frais (tableau 1 et Figure 2). Les résultats de la motilité (moyenne ± S.E.M., n = 18) a montré une motilité totale plus élevée et une motilité progressive en sperme frais que la motilité ...

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Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocoles pour la cryoconservation de maturation et de sperme anguille d’Europe ont été améliorés ces dernières années. Cet article décrit le meilleur protocole disponible à l’aide de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) pour induire la maturation et le méthanol comme cryoprotectant.

Manutention et traitement des anguilles mâles sur l’Europe (Anguilla anguilla) pour Maturation hormonale et cryoconservation de sperme

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

7.8K vues.  Universitat Politècnica de València. Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

Vidéo: Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation et<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturation du<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

Isolement et cryoconservation des rats nouveau-nés cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Modifié MicroSecure Vitrification: Une très procédure Cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

Maturation des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines dans la stimulation électrique Biowires utilisant

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

Induction et la Validation de la sénescence cellulaire dans les cellules humaines primaires

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

Fluorimétrique Techniques pour l’évaluation des Membranes des spermatozoïdes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Mesure du sperme guidage et motilité dans le Caenorhabditis elegans hermaphrodite appareil de reproduction

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Combinaison de l’imagerie avec un système d’administration stimulant pour étudier le sperme de souris vivante

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

Pleins feux sur l’auteur : Une technique d’imagerie de cellules vivantes pour étudier la signalisation calcique et l’exocytose de l’acrosome dans le sperme de souris 

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

Imagerie en temps réel de la dynamique acrosomique du calcium et de l’exocytose dans les spermatozoïdes de souris vivants

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...