Esta publicação foi financiada pela pesquisa de Horizonte 2020 da União Europeia e o programa de inovação no âmbito do acordo de concessão de Marie Sklodowska-Curie não 642893 (IMPRESS), o escritório de custo (custo de ação FA 1205, AQUAGAMETE) e o centro de excelência em pesquisa- 1476-4/2016/FEKUT.

Todos os procedimentos para trabalhar com enguia europeia descrita neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de ética da experimentação do Animal na Universitat Politécnica de València, seguindo as leis espanholas e regulamentos controlando as experiências e procedimentos em animais vivos.
1. peixe de manutenção
<ol><li>Trazer as enguias europeias para uma instalação de pesquisa e colocá-los em um aquário de 200 L com um sistema de recirculação. Uso de termostatos e refrigeradores para manter uma temperatura constante de 20 ° C.</li>
	<li>Mantenha o peixe no escuro para evitar stress22 e sem comida durante o experimento.</li>
	<li>Manter o peixe em água doce durante os 3 primeiros dias. Então mudar 1/3 da água e encha novamente com água do mar todos os dias até atingir uma salinidade de 37,0 ± 0,3 g/L.</li>
</ol>2. tratamento hormonal
Nota: O tratamento hormonal consiste em injeções semanais de gonadotrofina coriônica humana (hCG) durante toda a duração inteira (nove semanas) do experimento.
<ol><li>Preparar o hormônio hCG antecipadamente em uma concentração de 1 IU / µ l diluindo o hormônio em solução salina (0,9% NaCl). Nota: O hormônio pode ser preservado diluído nessa concentração para mais de uma semana a-18 ° C.</li>
	<li>Para anestesiar o peixe, prepare um balde de flexível de 40 L com 5 L de água do sistema.<ol>
<li>Em um balão de 250 mL, dilua 300 mg de benzocaína em 100 mL de etanol a 70%.</li>
		<li>Despeje a benzocaína diluída na caçamba (concentração final 0,36 mM) e misture bem. Isto é para uma concentração final de benzocaína de 60 mg/L.</li>
		<li>Transfira o peixe, individualmente, para a água com benzocaína e aguarde alguns segundos até que a benzocaína entra em vigor e o peixe está devidamente anestesiado. Nota: Para confirmar que o peixe é anestesiado, coloque o peixe em posição supina e verificar que ela permaneça ainda nessa posição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para administrar o hormônio, pesar o peixe e preparar o hormônio hCG na dose de 1,5 UI/g de peixe, um tubo de plástico de 1,5 mL.<ol>
<li>Encha uma seringa de 1 mL com o hormônio hCG do tubo de plástico.</li>
		<li>Coloque o peixe anestesiado, em posição supina e com a assistência ou a seringa, injetar o hormônio cuidadosamente na área intraperitoneal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Devolver o peixe para o aquário e monitorá-lo até que se recuperou totalmente. Nota: A administração hormonal tem que ser realizados semanalmente durante o experimento. Normalmente, as enguias europeus começam spermating após 6-7 semanas de tratamento hormonal.</li>
</ol>3. esperma amostragem
<ol><li>Para obter as melhores amostras de qualidade, extrair esperma 24 h após a administração hormonal6,23.</li>
	<li>Anestesia o peixe com benzocaína, conforme descrito no passo 2.2.</li>
	<li>Coloque o peixe anestesiado em posição supina, limpe a área genital com um esguicho de água destilada e seque cuidadosamente com papel, para evitar a contaminação de fezes presente na área genital ou ativação acidental esperma pelo contato com água do mar vem as aquários.</li>
	<li>Colocando os dedos de ambos os lados laterais do peixe, massagem cuidadosamente pressionando lateralmente das barbatanas peitorais para a área genital para forçar o esperma para fora.<ol>
<li>Repita a massagem até que não mais esperma sai da abertura genital.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colete o esperma em tubos de plástico de 15 mL usando uma bomba de vácuo.</li>
	<li>Dilua o esperma extraído 01:10 em modificados Tanaka´s extensor solução24 (137 mM NaCl, NaHCO3, em água destilada de 76,2 mM) a 4 ° c. Nota: O esperma na solução extensor deve ser mantido a 4 ° c.</li>
</ol>4. avaliação da qualidade de esperma
<ol><li>Preparar a água do mar artificial13 (em mM: NaCl 354.7, MgCl2 52,4, CaCl2 9.9, Na2SO4 28,2, 9,4 de KCl, em água destilada) com 2% albumina de soro bovino (BSA) (w:v), ajustar o pH a 8.2, osmolalidade mOsm/kg de 1100 e manter é a 4 ° c para evitar o crescimento bacteriano.</li>
	<li>Abra o software para análise de esperma assistida por computador (CASA) e selecione o módulo do esperma de peixe.<ol>
<li>Clique em Propriedades para abrir a configuração do software do sistema. Lá, defina as opções de captura em 60 imagens por segundo. Selecione fase negativa óptica, câmara de Makler e escala de X 10.</li>
		<li>Os valores de análise, selecione peixes como espécie e área de partículas maiores que 2 µm2 e menor que 20 µm2.</li>
		<li>Sobre os parâmetros de velocidade, definida como lenta quando as células mover-se entre 10 e 45 µm/s, definido como médio , quando se deslocam entre 45 e 100 µm/s e definida como rápida quando se movendo mais rápido do que 100 µm/s. Nota: Espermatozoides com mais lento do que 10 µm/s de velocidade foram considerados fixa.</li>
		<li>Selecione os valores progressivos como 80% da retidão (STR) e salvar as propriedades.</li>
		<li>Clique no Campo de captura (uma janela com as imagens ao vivo da câmera será aberta). Nota: O sistema de análise de esperma assistida por computador é formado por um microscópio, uma câmera e um software de análise de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na câmara de contagem, coloque 4 µ l de água do mar artificial e adicione 0,5 µ l de solução de esperma (esperma diluída em solução de extensor).<ol>
<li>Focar a imagem com o microscópio com ampliação de 10x na fase negativa. 15 s após a ativação, clique em capturar - de vídeo do software de análise de esperma assistida por computador.</li>
		<li>Analise cada amostra em triplicado e selecionadas amostras com uma mobilidade superior a 70% para criopreservação. Nota: É muito importante selecionar apenas espermatozoides de alta qualidade para o sucesso do presente protocolo de criopreservação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. método de congelamento de esperma
<ol><li>Prepare antecipadamente o nitrogénio (aproximadamente 2,5 L) em um 34 x 34 cm x 30 cm e grossa caixa de isopor de 5 cm. Nota: Manter um nível de nitrogênio líquido de 4-5 cm de altura em todos os momentos.<ol>
<li>Construa uma estrutura flutuante para pre-congelar o esperma. Use 2 pedaços de isopor (20 cm x 5 cm), ligá-los com 2 tubos de plástico e coloque a estrutura sobre o nitrogênio líquido. Essa estrutura precisa flutuar sobre o nitrogênio líquido a uma altura aproximada de 3 cm sobre a superfície (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56835/56835fig1.jpg"> Figura 1 . Esquemático, desenho da estrutura flutuante usada para pré-congelamento com nitrogênio líquido. A estrutura é composta de duas peças de baixa densidade de isopor de 20 cm x 4 cm x 5 cm conectado com tubos de plástico de 14 cm. As palhetas são colocadas sobre os tubos de plástico a 3 cm sobre o nitrogênio líquido. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56835/56835fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>Preparar a solução de criopreservação misturando esperma, solução de extensor e metanol na proporção de 1:8:1 em plástico de 1,5 mL a tubos e mexa delicadamente.</li>
	<li>Com a ajuda de uma pipeta, adicione 480 µ l da solução de criopreservação nos 500 canudos µ l e se necessário, marcá-los, fechando uma extremidade com argila de modelagem.</li>
	<li>Colocar a palha no dispositivo flutuante a uma altura de 3 cm sobre o nitrogênio líquido por 3 min. Em seguida, coloque a palha para o nitrogênio líquido.</li>
	<li>Após 10-15 min, transfira os canudos em um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido usando pinça longa e mantê-los submersos em nitrogênio líquido em todos os momentos. Aqui, o esperma pode ser armazenado indefinidamente.</li>
</ol>6. método de descongelamento
<ol><li>Preparar uma caixa de isopor com nitrogênio líquido, conforme descrito na etapa 5.1 e preparar um banho de água usando um copo de 3 L com água da torneira a 40 ° c.</li>
	<li>Transferi o palitinho com esperma congelado do tanque de armazenamento na caixa de isopor com nitrogênio líquido, usando pinça longa.<ol>
<li>Coloque cada palha em um banho de água a 40 ° c para 13 s.</li>
		<li>Despeje o esperma em um tubo de plástico de 1,5 mL cortando as extremidades fechadas da palha com uma tesoura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise a mobilidade do esperma, usando o sistema de análise de esperma assistida por computador, como explicado no passo 4.1.</li>
	<li>Manter 100 µ l de esperma para analisar a viabilidade de espermatozoides com um citômetro de fluxo.</li>
</ol>7. fluxo Cytometry
<ol><li>Use um kit fluorescente contendo iodeto de propidium (PI), que é um composto fluorescente vermelho que mancha os núcleos das células mortas e um membrana-permeant nuclear composto fluorescente, que verde manchas os núcleos das células vivas.<ol>
<li>Prepare a solução de coloração verde fluorescente, diluindo-a partir da solução-mãe (1mm) 01:10 Tanaka´s médio para uma solução de trabalho de 100 µM.</li>
		<li>Não dilua a solução de PI. A solução é a 2,4 mM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cada amostra, tomar 50 µ l de esperma fresca ou descongelada e adicione 0,5 µ l de verde fluorescente, manchando a solução de trabalho (concentração final de 1 µM) e 2 µ l da solução de PI (concentração final de 100 µM).</li>
	<li>Incube as amostras contendo os corantes (PI e a coloração verde fluorescente) no escuro por 5 min.<ol>
<li>Diluir as amostras em 500 µ l de solução de Tanaka´s extensor e analisar com o citômetro de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligue o citômetro de fluxo e criar um novo protocolo que contém pelo menos 2 terrenos: SS log log de vs FS e vs FL1 FL3. Nota: Ambos, verde fluorescente iodeto de coloração e propidium pode ser excitado com comprimento de onda visível luz. Quando ligado ao DNA, a emissão de fluorescência máxima destes corantes são 516 nm e 617 nm, respectivamente.<ol>
<li>Ajustar as tensões dos diferentes lasers: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372</li>
		<li>Configurar o acordo de aquisição configurações para eventos máximos = 5000 ou 15 s (a concentração final da amostra deve ser de aproximadamente 1 milhão de células/mL). Leia a amostra usando um fluxo baixo .</li>
		<li>Selecione o modo de leitura único tubo fixada modo posição.</li>
		<li>Colocar a amostra no número certo de carrossel</li>
		<li>Leia a amostra (pressionando F9) e salvar os dados coletados para um arquivo do excel (pressionando F7) para posterior análise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>ICES_Working_Group_on_Eels. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).</li><li>Moriarty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Catches+of+Elver+of+1928-1988.">European Catches of Elver of 1928-1988.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).</li><li>Dekker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+geometry+of+the+European+eel+stock.">The fractal geometry of the European eel stock.</a> ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).</li><li>Jacoby, D., Gollock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hCG+as+spermiation+inducer+on+European+eel+semen+quality.">Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality.</a> Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).</li><li>P&#233;rez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+and+spermiation+in+the+male+European+eel:+assessment+of+sperm+quality+throughout+treatment.">Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment.</a> J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+effects+of+thermal+regime+and+alternative+hormonal+treatments+on+the+reproductive+performance+of+European+eel+males+(Anguilla+anguilla)+during+induced+sexual+maturation.">Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation.</a> Aquaculture. 354, 7-16 (2012).</li><li>Asturiano, J. F., S&#248;rensen, S. R., P&#233;rez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Production+of+Larvae+Using+Cryopreserved+Sperm:+Effects+of+Preservation+Temperature+and+Cryopreservation+on+European+Eel+Sperm+Fertilization+Capacity.">First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity.</a> Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).</li><li>Di Biase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-treatment+with+androgens+during+artificial+induction+of+maturation+in+female+eel,+Anguilla+anguilla:+Effects+on+egg+production+and+early+development.">Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development.</a> Aquaculture. 479, 508-515 (2017).</li><li>Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+in+female+silver+eels,+Anguilla+australis:+The+benefits+of+androgen+pre-treatment.">Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment.</a> Aquaculture. 437, 111-119 (2015).</li><li>Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+manipulations+for+the+enhancement+of+sperm+production+in+cultured+fish+and+evaluation+of+sperm+quality.">Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality.</a> Aquaculture. , (2016).</li><li>Ohta, H., Izawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diluent+for+cool+storage+of+the+Japanese+eel+(Anguilla+japonica)+spermatozoa.">Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa.</a> Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Eel+Sperm+Diluent+for+Short-term+Storage.">European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage.</a> Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).</li><li>Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+by+the+environmental+concentration+of+ions+of+the+potential+for+motility+in+Japanese+eel+spermatozoa.">Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa.</a> Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm.">Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physio-chemical+characteristics+of+seminal+plasma+and+development+of+media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+sperm.">Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).</li><li>Szab&#243;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm+using+different+extenders+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants.</a> Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sperm+of+farmed+European+eel+Anguilla+anguilla.">Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla.</a> J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., P&#233;rez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+European+eel+sperm+cryopreservation+method+by+preventing+spermatozoa+movement+activation+caused+by+cryoprotectants.">Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants.</a> Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).</li><li>Marco-Jim&#233;nez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+spermatozoa:+effect+of+dilution+ratio,+foetal+bovine+serum+supplementation,+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants.</a> Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sperm+cryopreservation+on+the+European+eel+sperm+viability+and+spermatozoa+morphology.">Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology.</a> Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).</li><li>Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Sexual+Maturation+in+Wild+Female+European+Eels+(Anguilla+anguilla)+in+Darkness+and+Light.">Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light.</a> Isr. J. Aquac. 64, (2012).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+and+fertilization+in+the+Japanese+eel,+Anguilla+japonica.">Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica.</a> Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cryopreservation+of+sperm+of+Japanese+eel.">Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel.</a> J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+pattern+of+eel+spermatozoa+is+affected+by+post-activation+time,+hormonal+treatment+and+the+thermal+regimen.">Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen.</a> Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).</li><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-assisted+sperm+analysis+(CASA)+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish.">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).</li><li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+sperm+motility+and+factors+affecting+sperm+quality+in+cultured+fish.">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).</li><li>Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice.">Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).</li><li>Magnotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+vitrification+of+fish+semen:+a+review+with+special+emphasis+on+marine+species.">Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species.</a> Rev. Aquacult. , (2016).</li><li>Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domaga&#322;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-thawed+motility+and+fertility+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar+L.)+sperm+frozen+with+four+cryodiluents+in+straws+or+pellets.">Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets.</a> Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).</li><li>Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitable+methods+for+cryopreservation+of+semen+from+Atlantic+halibut,+Hippoglossus+hippoglossus+L.">Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L.</a> Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+eel+(Anguilla+japonica+Temminck+&amp;+Schlegel,+1846)+propagation+using+cryopreserved+sperm+samples.">Japanese eel (Anguilla japonica Temminck &amp; Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples.</a> J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).</li></ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Este protocolo descreve o processo completo para criopreservação de esperma, a manipulação e a maturação de enguia europeia. As condições de criação descritas aqui são ideais para rápida maturação e produção de grandes volumes de espermatozoides de alta qualidade nesta espécie 6,7,25. O sucesso do presente protocolo de criopreservação e seu uso potencial para a fertilização pós-descongelação dependem gran...

Nos últimos 25 anos, o número da enguia europeia (Anguilla anguilla) chegando no litoral europeu diminuíram progressivamente 90% 1,2,3. Existem vários fatores que explicam essa queda drástica, incluindo a poluição, infecções, destruição de sobrepesca e habitat. Tudo isso teve um efeito profundo sobre esta espécie, levando à inclusão da enguia europeia na União Internacional para a lista de conservação da natureza (IUCN) como em perigo crítico 4. Consequentemente, o desenvolvimento de técnicas e protocolos para a reprodução em cativeiro são necessárias.
A maturação da enguia europeia em cativeiro é alcançada pelo tratamento hormonal 5,6,7 , mas a produção de gametas em ambos os sexos é difícil sincronizar a 8. Mesmo que o desenvolvimento de novos implantes de andrógeno tem mostrado para acelerar a ovogênese em enguias 9,10, o tempo de maturação final nas fêmeas ainda é altamente variável e difícil de controlar 11. Portanto, a curto prazo armazenamento de esperma 12,13,14 e criopreservação técnicas são necessárias para a gestão da reprodução, tornando o gameta sincronização desnecessária 8.
Criopreservação de esperma de enguia europeia tem sido desenvolvida desde 2003 15,16. Vários pesquisadores projetado protocolos bem sucedidos usando dimetilsulfóxido (DMSO) ou metanol como crioprotectores 16,17,18,19,20. Embora ambos os protocolos têm sido utilizados com sucesso, a viabilidade de células obtidas de espermatozoides descongelados criopreservadas com DMSO é inferior com metanol 20,21. Além disso, a enguia esperma é ativada em contato com DMSO e requer mais tedioso esperma manipulação 19, portanto o metanol é um crioprotetor mais adequado para que o esperma de enguia europeia que DMSO.
Aqui, o protocolo de tratamento ideal e tratamento hormonal da enguia europeia será descrito abaixo. Além disso, o melhor protocolo de criopreservação de esperma de enguia europeia utilizando metanol como um crioprotetor e um protocolo para a avaliação da qualidade do esperma nesta espécie também será descrito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:151px;">AQUACEN BENZOCA&#205;NA +D2A2:D24</td>
			<td style="width:128px;">AQUACEN</td>
			<td style="width:119px;">3394ESP</td>
			<td style="width:141px;">Benzocaine</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>3624-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>305501</td>
			<td>Syringe 1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FC500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Air pump 100</td>
			<td>EHEIM</td>
			<td>4011708370032</td>
			<td>Modified for suction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Eppendorf 1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>175508</td>
			<td>Plastic tubes 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>175747</td>
			<td>Plastic tubes 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flexible bucket</td>
			<td>Fiel</td>
			<td>1040101</td>
			<td>40 L, Black color.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ethanol</td>
			<td>Guinama SL</td>
			<td>Mg96270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyopreservation straws&#160;</td>
			<td>IMV Technologies</td>
			<td>14550</td>
			<td>500 &#181;L straws</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Live/Dead Sperm Viability Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7011</td>
			<td>Cytometer Kit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Modelling clay</td>
			<td>JOVI</td>
			<td>Art 30</td>
			<td>4 different colors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Precision scale PCB</td>
			<td>KERN &#38; Sohn GmbH</td>
			<td>PCB35002</td>
			<td>Digital scale</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saline solution Vitulia 0.9%</td>
			<td>Laboratorios Ern, S.A.</td>
			<td>C.N. 999790.8</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Forceps</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3710025</td>
			<td>30 cm metal forceps</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Scissors</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3700014</td>
			<td>Scissors 14cm</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ovitrelle (r-hCG)</td>
			<td>Merck SL</td>
			<td>EMEA/H/C/000320</td>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>2112211210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2SO4</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>3257091611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaHCO3</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>1416381210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">782M Camera</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>782M</td>
			<td>Camera for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ISAS v1</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>ISAS v1</td>
			<td>CASA software</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SpermTrack-10</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>SpermTrack-10</td>
			<td>Countig chamber for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Beaker Pyrex 3L</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>2110668</td>
			<td>Glass beaker 3L</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flask Pyrex 250 GL-45</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>21801365</td>
			<td>Glass flask 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>PO02000500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Methanol</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>ME03061000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>MA00370500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05482</td>
			<td>Bovine serum albumina</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Styrofoam box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34x34x30 cm and 5cm thick</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and treatment of male european eels (anguilla anguilla) for hormonal maturation and sperm cryopreservation

Durante os últimos anos, diversos grupos de pesquisa têm trabalhado no desenvolvimento e aperfeiçoamento de novos protocolos para o tratamento de enguia europeia e maturação. A partir de ainda, injeções semanais de gonadotrofina coriônica humana (hCG) demonstraram maturate machos após apenas 5-6 semanas de tratamento, produzindo grandes volumes de espermatozoides de alta qualidade durante várias semanas. Além disso, protocolos de criopreservação de esperma usando diferentes extensores, crioprotectores e refrigeração e descongelamento vezes foram anteriormente descritas para a enguia europeia. Aqui, nós mostramos que solução de extensor de Tanaka´s pode ser usada diretamente para a fertilização ou para criopreservação, tornando desnecessária a utilização de diferentes tipos de soluções e diluições. Além disso, o uso do metanol como um crioprotetor faz este protocolo fácil de usar como metanol tem baixa toxicidade e não ativa o esperma. O esperma não precisa ser criopreservado imediatamente após a adição do crioprotetor, e pode ser usado muito tempo depois de ser descongelado. Além disso, é ainda alta motilidade espermática pós-descongelação embora seja menor do que de esperma fresca. O objetivo deste trabalho é mostrar o melhor protocolo disponível para a enguia europeia, manipulação, maturação e criopreservação de esperma.

Esperma de 18 enguias com uma mobilidade do esperma de 70% ou superior, foi selecionado para este estudo. Os resultados mostraram uma redução em todos os parâmetros de qualidade após descongelamento comparados de esperma fresca (tabela 1 e Figura 2). Os resultados de motilidade (média ± no MEV mostrou, n = 18) mostrou uma maior motilidade total e uma motilidade progressiva no esperma fresca do que o total mobilidade e motilidade progres...

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Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocolos de criopreservação de maturação e esperma de enguia Europeia foram melhorados nos últimos anos. Este artigo descreve o melhor protocolo disponível usando gonadotrofina coriônica humana (hCG) para induzir a maturação e metanol como crioprotetor.

Manipulação e tratamento de macho Europeu enguias (Anguilla anguilla) para maturação Hormonal e criopreservação de esperma

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

handling-treatment-male-european-eels-anguilla-anguilla-for-hormonal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

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