L’objectif de ces procédures est d’évaluer l’intégrité des membranes de sperme à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques combinées à une microscopie de fluorescence ou à une analyse de cytométrie du débit. Ces techniques pourraient aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la reproduction telles que la prédiction du potentiel de fécondation et la qualité de l’échantillon de sperme. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles permettent une évaluation précise de plusieurs membranes spermatozoïdes qui sont connues pour s’associer au potentiel de fécondation du sperme.
Les implications de ces techniques s’étendent au diagnostic de la qualité d’éjaculat car elle permet l’évaluation plus précise du plasma de sperme et de l’intégrité de membrane acrosome aussi bien que le potentiel mitochondrique de membrane. Pour commencer cette procédure, obtenir environ un à six millilitres de sperme de taureau dans un tube de 15 millilitres à température ambiante. Ajouter six millilitres de tampon NKM préchauffés à 37 degrés Celsius à chacun un millilitre de sperme.
Centrifugeuse à 600 fois g pendant huit minutes. Répétez la centrifugation une ou deux fois jusqu’à ce que le supernatant soit clair. Après cela, jetez immédiatement la majeure partie du surnatant, laissant environ un centimètre de supernatant au-dessus de la pastille.
Penchez soigneusement les tubes à un angle de 30 degrés dans l’incubateur et attendez 20 à 30 minutes pour permettre au spermatozoa de nager vers le haut. À l’aide d’une micropipette, retirer soigneusement le millilitre restant de supernatant qui contient maintenant le spermatozoa motile et le transférer dans un tube frais de 1,5 millilitre. Gardez le sperme à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
Tout d’abord, préparez toutes les solutions de stock nécessaires telles qu’décrites dans le protocole textuel. Ensuite, transférez 133 microlitres du spermatozoa motile à une concentration de 25 millions de spermatozoïdes par millilitre à un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 17 microlitres de la solution de travail DAPI et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Centrifugeuse à 1000 fois g pendant 5 minutes. Jetez le supernatant et ajoutez 100 microlitres de tampon NKM à la pastille. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de FITC-PSA, deux microlitres de JC-1 et trois microlitres de PI. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Centrifugeuse à 1000 fois g pendant 5 minutes. Jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans 40 microlitres de tampon NKM. Transférer ensuite 10 microlitres de l’échantillon sur une lame de verre.
Enduitez l’échantillon et ajoutez un coverslip. Après cela, commencez immédiatement à visualiser l’échantillon par microscopie d’épifluorescence avec un objectif 40X et un triple filtre tel que décrit dans le protocole de texte, à l’aide d’un appareil photo numérique pour capturer une image distincte pour chaque filtre. Utilisez l’option de fusion dans le logiciel de la caméra pour fusionner les trois images reçues des filtres, en sauvant le nouveau fichier au format JPEG.
Ouvrez l’image fusionnée avec l’outil de peinture et utilisez l’option brosse pour marquer le spermatozoa compté. Ensuite, classer le spermatozoa en fonction de la fluorescence émise par chaque sonde, en s’assurant d’évaluer au moins 200 spermatozoa par diapositive. Toutes les cellules doivent apparaître bleues à partir du DAPI.
Comptez les cellules mortes, qui semblent violettes, pour évaluer la viabilité. Ensuite, utilisez les modèles de coloration par fluorescence pour évaluer l’état acrosome. Enfin, évaluez le potentiel de la membrane mitochondrique en distinguant le spermatozoa avec un potentiel de membrane mitochondriale élevé qui présentent un milieu teinté de rouge du spermatozoa avec un faible potentiel memitochondrial qui présentent un milieu teinté de vert.
Comptez séparément les midpieces rouges et verts et calculez leur ratio. Pour commencer l’évaluation de l’intégrité de la membrane plasmatique, prenez le nombre désiré de puits de la trousse de viabilité et de concentration. Transférez les puits à la base de travail et couvrez-les d’un couvercle flexible pour les protéger de la lumière.
Ajouter 199 microlitres de solution tamponnée pour la cytométrie à chaque puits. Ajoutez ensuite un microlitre de sperme homogène à une concentration de 57 millions de cellules par millilitre à chaque puits et homogénéisez par pipetting. Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Après cela, exécutez l’échantillon à travers le cytomètre d’écoulement en utilisant le réglage de viabilité. Pour commencer à évaluer le potentiel de la membrane mitochondrique, sortez le nombre désiré de puits de la trousse d’activité mitochondriale. Transférez-les à la base de travail.
Ajouter 10 microlitres d’éthanol absolu à chaque puits et utiliser une pipette pour réutiliser la poudre présente dans le puits. Ajouter 190 microlitres de PBS par puits et homogénéiser par pipetting. Ajouter 0,75 microlitres de sperme homogène à une concentration de 57 millions de cellules par millilitre à chaque puits et homogénéiser par pipetting.
Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, exécuter l’échantillon à travers le cytomètre d’écoulement en utilisant le réglage de l’activité mitochondrique. Pour commencer à évaluer l’intégrité de la membrane acrosomale, sortez le nombre désiré de puits de la viabilité et de la trousse d’intégrité acrosome.
Transférez les puits à la base de travail et couvrez-les d’un couvercle flexible pour les protéger de la lumière. Ajouter 200 microlitres de solution tamponnée pour la cytométrie à chaque puits. Ajoutez ensuite 0,7 microlitre de sperme homogène à une concentration de 57 millions de cellules par millilitre à chaque puits et homogénéisez par pipetting.
Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Après cela, exécutez l’échantillon à travers le cytomètre d’écoulement en utilisant le paramètre d’aperçu. Dans cette étude, la qualité du sperme est évaluée à l’aide de différentes techniques, dont l’une a évalué les membranes de sperme à l’aide de sondes fluorométriques.
Il est possible d’évaluer les différences dans la qualité de l’échantillon de sperme en termes d’intégrité membranaire. Par exemple, l’éjaculat du taureau numéro sept avait un pourcentage relativement faible de cellules mortes, une faible proportion de spermatozoïdes avec acrosome pseudo-réagi, et un potentiel memitochondrial plus élevé par rapport à l’éjaculat du taureau numéro un. Les échantillons sont ensuite évalués en fonction de leur viabilité et de leur activité mitochondriale.
Les histogrammes pour ces exemples représentatifs représentent le spermatozoa nongated et les débris et le spermatozoa fermé. Ces histogrammes représentent également les cellules viables et mortes et la distribution du spermatozoa à la membrane mitochondriale polarisée et dépollisée. L’intégrité de l’acrosome est ensuite évaluée à l’moyen d’un kit prêt à l’emploi et lue avec cytométrie d’écoulement, divisant la zone en trois zones marqueurs qui représentent des cellules fluorées faibles négligeables avec des cellules intactes acrosomes non tachées et à faible fluoration avec une partie tachée résiduelle de l’acrosome, et des cellules fortement fluorées avec acrosome perturbé.
Tout en essayant ces procédures, il est important de s’assurer de bien préparer l’échantillon de sperme initial. Ces techniques peuvent fournir un aperçu de l’évaluation de la qualité du sperme et peuvent être appliquées à divers organismes tels que les bovins, les volailles et les humains. La comparaison entre les deux techniques, la quadruple coloration et la cytométrie d’écoulement n’a indiqué aucune différence significative pour la viabilité, le potentiel mitochondrique de membrane, et l’intégrité acrosome révélant que les deux techniques ont produit des résultats assortis.
