هذا المنشور كان يموله أفق 2020 البحث الاتحاد الأوروبي في والابتكار برنامج إطار المنحة ماري سكلودوفسكا-كوري لا 642893 (إعجاب)، مكتب التكلفة (تكلفة العمل فا 1205، أقواجاميتي)، ومركز البحوث للتميز- 1476-4/2016/فكة.

وقد أقر جميع الإجراءات للعمل مع ثعبان الموصوفة في هذا البروتوكول "لجنة أخلاقيات التجريب الحيوان" في جامعة Politècnica دي València، وفقا للقوانين الإسبانية وقواعد تنظيمية لمراقبة التجارب و الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الحية.
1-الأسماك الصيانة
<ol><li>جلب الثعابين الأوروبية إلى مرفق بحوث ووضعها في الأحواض المائية 200 لتر مع نظام إعادة تدوير. استخدام الحرارة ومبردات للحفاظ على درجة حرارة ثابتة في 20 درجة مئوية.</li>
	<li>الحفاظ على الأسماك في ظروف مظلمة لتجنب الإجهاد22 ومع أي طعام أثناء التجربة.</li>
	<li>الحفاظ على الأسماك في المياه العذبة خلال أول 3 أيام. ثم تغيير 1/3 ماء والملء بمياه البحر كل يوم حتى وصلت إلى ملوحة من 37.0 ± 0.3 غ/ل.</li>
</ol>2. العلاج الهرموني
ملاحظة: العلاج الهرموني يتكون من حقن أسبوعية تروج المشيمية البشرية (hCG) طوال المدة (تسعة أسابيع) بأسرها من التجربة.
<ol><li>تعد قوات حرس السواحل الهايتية هرمون مسبقاً في تركيز 1 وحدة دولية/ميليلتر بتمييع هذا الهرمون في المحلول الملحي (0.9% كلوريد الصوديوم). ملاحظة: هذا الهرمون يمكن الحفاظ على المخفف بتركيز هذا لأكثر من أسبوع عند-18 درجة مئوية.</li>
	<li>لتخدير الأسماك، تحضير دلو ل 40 مرنة مع 5 لتر من الماء النظام.<ol>
<li>في قارورة 250 مل، تمييع 300 ملغ البنزوكائين في 100 مل إيثانول 70%.</li>
		<li>من أجل البنزوكائين المخفف في الدلو (التركيز النهائي 0.36 مم) وتخلط بشكل صحيح. هذا لتركيز البنزوكائين نهائي من 60 مغ/لتر.</li>
		<li>نقل الأسماك، كل على حدة، في الماء مع البنزوكائين وانتظر بضع ثوان حتى البنزوكائين سريان مفعول والأسماك يتم تخديره بشكل صحيح. ملاحظة: للتأكد من أن يتم تخديره من الأسماك، وضع السمك في موقف ضعيف والتحقق من أن يبقى في هذا الموقف.</li>
	</ol>
</li>
	<li>أن تول الهرمون وزن الأسماك وإعداد قوات حرس السواحل الهايتية الهرمون بجرعة 1.5 وحدة دولية/غرام أسماك، في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل.<ol>
<li>ملء حقنه 1 مل مع قوات حرس السواحل الهايتية الهرمون من أنبوب بلاستيكي.</li>
		<li>ضع السمك أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف ومع المساعدة أو المحاقن، حقن الهرمونات بعناية في منطقة داخل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إرجاع السمك للأحواض المائية ورصد حتى شُفي تماما. ملاحظة: الإدارة الهرمونية قد تجري أسبوعيا طوال التجربة. عادة، تبدأ ثعبان سبيرماتينج بعد 6-7 أسابيع من العلاج الهرموني.</li>
</ol>3. أخذ عينات من الحيوانات المنوية
<ol><li>للحصول على عينات ذات جودة أفضل، استخراج الحيوانات المنوية 24 ساعة بعد6،الإدارة الهرمونية23.</li>
	<li>تخدير السمك مع البنزوكائين كما هو موضح في الخطوة 2، 2.</li>
	<li>ضع السمك أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف وتنظيف المنطقة التناسلية مع بخ ماء المقطر والجاف بعناية مع الورق، لتجنب تلوث البراز الموجودة في المنطقة التناسلية أو تنشيط الحيوانات المنوية عرضي بالاتصال مع مياه البحر من الأحواض المائية.</li>
	<li>وضع الأصابع على كلا الجانبين الجانبي من الأسماك، تدليك بعناية الضغط جانبياً من الزعانف الصدرية إلى المنطقة التناسلية قوة الحيوانات المنوية خارجاً.<ol>
<li>كرر التدليك حتى لا أكثر من الحيوانات المنوية يخرج من فتح الأعضاء التناسلية للإناث.</li>
	</ol>
</li>
	<li>جمع الحيوانات المنوية في أنابيب بلاستيكية 15 مل باستخدام مضخة فراغ.</li>
	<li>تمييع الحيوانات المنوية المستخرجة 01:10 في تعديل Tanaka´s الموسع حل24 (مم 137 كلوريد الصوديوم، 76.2 مم NaHCO3، في الماء المقطر) في 4 درجة مئوية. ملاحظة: ينبغي أن تبقى الحيوانات المنوية في الحل الموسع عند 4 درجة مئوية.</li>
</ol>4. تقييم جودة الحيوانات المنوية
<ol><li>تعد مياه البحر الاصطناعي13 (مم: كلوريد الصوديوم 354.7، مجكل2 52.4، كاكل2 9.9، غ2هكذا4 28.2، 9.4 بوكل، في الماء المقطر) مع 2% ألبومين المصل البقري (BSA) (w:v)، ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.2، أوسمولاليتي لموسم 1100 كيلوجرام، والحفاظ على ففي 4 درجة مئوية لتجنب النمو الجرثومي.</li>
	<li>افتح البرنامج لتحليل الحيوانات المنوية الحاسوب (CASA)، وحدد الوحدة النمطية الحيوانات المنوية الأسماك.<ol>
<li>انقر فوق خصائص لفتح إعداد النظام للبرنامج. هناك، تعيين خيارات الالتقاط في 60 صورة في الثانية الواحدة. حدد المرحلة السلبية البصريات، الدائرة ماكلير ومقياس X 10.</li>
		<li>ثم على التحليل القيم، حدد الأسماك حسب الأنواع و مجال الجزيئات أكبر من 2 ميكرومتر2 وأصغر من 20 ميكرومتر2.</li>
		<li>على المعلمات السرعة، تعيين إلى بطء عند الخلايا الانتقال بين 10 و 45 ميكرومتر/s، وتعيين إلى متوسط عند الانتقال بين 45 و 100 ميكرومتر/s وتعيين إلى السريع عندما تتحرك أسرع من 100 ميكرومتر/s. ملاحظة: تعتبر اسم المني بسرعة أبطأ من 10 ميكرون/s.</li>
		<li>قم بتحديد القيم التقدمية 80 ٪ من الاستقامة (STR) وحفظ الخصائص.</li>
		<li>انقر فوق الحقل التقاط (سيتم فتح نافذة مع الصور مباشرة من الكاميرا). ملاحظة: يتم تشكيل نظام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب مجهر وكاميرا وبرنامج تحليل صورة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>في قاعة الفرز، وضعت 4 ميليلتر من مياه البحر الاصطناعي وإضافة 0.5 ميليلتر من حل الحيوانات المنوية (الحيوانات المنوية تضعف في حل موسع).<ol>
<li>التركيز الصورة مع المجهر بتكبير X 10 في مرحلة سلبية. 15 s بعد التنشيط، انقر فوق التقاط-من الفيديو في برنامج تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب.</li>
		<li>تحليل كل عينة في تتبع وتحديد العينات مع حركية أعلى من 70% لنعد. ملاحظة: من المهم جداً لتحديد فقط جودة الحيوانات المنوية لنجاح هذا البروتوكول للواسمات.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. طريقة تجميد الحيوانات المنوية
<ol><li>تحضير النيتروجين السائل في وقت مبكر (حوالي 2.5 لتر) في 34 سم × 34 سم × 30 سم و 5 سم مربع الستايروفوم سميكة. ملاحظة: الاحتفاظ بمستوى النتروجين السائل من 4-5 سم الارتفاع في جميع الأوقات.<ol>
<li>بناء هيكل عائم قبل تجميد الحيوانات المنوية. استخدام 2 قطعة من البوليسترين (20 سم × 5 سم) وربطها بأنابيب بلاستيكية 2، ووضع الهيكل على النتروجين السائل. ويلزم هذا الهيكل تطفو فوق النتروجين السائل الارتفاع تقريبي 3 سم فوق السطح (الشكل 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56835/56835fig1.jpg"> الشكل 1 . التخطيطي رسم هيكل عائم يستخدم لتجميد مسبقاً على النتروجين السائل. الهيكل يتكون من قطعتين من الكثافة السكانية المنخفضة الستايروفوم من 20 سم × 4 سم × 5 سم متصلة بأنابيب بلاستيكية من 14 سم. وتوضع القش عبر أنابيب بلاستيكية في 3 سم على النتروجين السائل. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56835/56835fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<ol start="2"><li>إعداد الحل نعد بخلط الحيوانات المنوية، والحل الموسع الميثانول في نسبة 1:8:1 في 1.5 مل البلاستيكية أنابيب ويقلب بلطف.</li>
	<li>مع المساعدة من ماصة، إضافة ميليلتر 480 الحل للواسمات في القش ميليلتر 500 وإذا لزم الأمر، وضع علامة عليها بإغلاق أحد طرفي مع نمذجة الطين.</li>
	<li>وضع القش على جهاز عائم على ارتفاع 3 سم على النتروجين السائل لمدة 3 دقائق. ثم، ضع القش في النيتروجين السائل.</li>
	<li>بعد 10-15 دقيقة، نقل القش في صهريج لتخزين نيتروجين سائل باستخدام الملقط طويلة والاحتفاظ بها غارقة في النتروجين السائل في جميع الأوقات. وهنا، يمكن تخزين الحيوانات المنوية إلى أجل غير مسمى.</li>
</ol>6-جمود الأسلوب
<ol><li>إعداد مربع الستايروفوم مع النيتروجين السائل كما هو موضح في الخطوة 5، 1، وإعداد حمام مائي باستخدام كوب 3 لتر بماء الصنبور في 40 درجة مئوية.</li>
	<li>نقل القش مع الحيوانات المنوية المجمدة من خزان التخزين في المربع الستايروفوم مع النتروجين السائل باستخدام الملقط طويلة.<ol>
<li>وضع كل سترو في حمام مائي في درجة 40 مئوية 13 ثانية.</li>
		<li>صب الحيوانات المنوية في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل بقطع نهايات مغلقة من القش مع المقص.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحليل عدد الحيوانات المنوية الحركة باستخدام نظام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب كما هو موضح في الخطوة 4، 1.</li>
	<li>تبقى 100 ميليلتر من الحيوانات المنوية لتحليل جدوى المني مع سيتوميتير تدفق.</li>
</ol>7-التدفق الخلوي
<ol><li>استخدام أدوات فلورسنت تتضمن يوديد propidium (PI)، وهو مركب نيون أحمر بقع نواة الخلايا الميتة، ومجمع فلورسنت غشاء بيرمينت نووية، أن الأخضر بقع نواة الخلايا الحية.<ol>
<li>إعداد الحل المصبوغة الفلورية الخضراء باذابته من الحل الأسهم (1 ملم) 01:10 في المتوسط Tanaka´s لإيجاد حل عملي من 100 ميكرومتر.</li>
		<li>عدم تمييع الحل بي. الحل الأسهم 2.4 ملم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لكل عينة، تأخذ 50 ميليلتر من الحيوانات المنوية الطازجة أو المذابة وإضافة 0.5 ميليلتر من الفلورية الخضراء تلطيخ العامل الحل (التركيز النهائي 1 ميكرومتر) و 2 ميليلتر من حل PI (تركيز نهائي 100 ميكرومتر).</li>
	<li>احتضان هذه العينات تحتوي على الصبغات (PI وتلطيخ الفلورية الخضراء) في الظلام لمدة 5 دقائق.<ol>
<li>تمييع هذه العينات في 500 ميليلتر من Tanaka´s الموسع حل وتحليل مع cytometer التدفق.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قم بتشغيل سيتوميتير تدفق وإنشاء بروتوكول جديد يحتوي على قطع مالا يقل عن 2: SS تسجيل سجل مقابل خ ومقابل FL1 FL3. ملاحظة: كلا، يمكن متحمس يوديد تلطيخ و propidium نيون مع الضوء المرئي الطول الموجي الأخضر. عندما تلتزم بالحمض النووي، هي انبعاث هذه الأصباغ الفلورية أقصى 516 نيوتن متر و 617 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي.<ol>
<li>ضبط الفولتية من أشعة الليزر المختلفة: SS = 199؛ خ م = 199؛ FL1 = 377؛ FL3 = 372</li>
		<li>قم بإعداد الاتفاق الحصول على إعدادات لإحداث أقصى = 5000 أو 15 ثانية (يجب أن يكون التركيز النهائي للعينة حوالي 1 مليون من خلايا/مل). قراءة العينة باستخدام تدفق المنخفض .</li>
		<li>حدد وضع القراءة أنبوب واحد ثابت وضع الموقف.</li>
		<li>وضع العينة في العدد الصحيح دائري</li>
		<li>قراءة العينة (الضغط على F9) وحفظ البيانات إلى ملف excel (ضغط F7) لمزيد من التحليل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>ICES_Working_Group_on_Eels. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).</li><li>Moriarty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Catches+of+Elver+of+1928-1988.">European Catches of Elver of 1928-1988.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).</li><li>Dekker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+geometry+of+the+European+eel+stock.">The fractal geometry of the European eel stock.</a> ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).</li><li>Jacoby, D., Gollock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hCG+as+spermiation+inducer+on+European+eel+semen+quality.">Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality.</a> Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).</li><li>P&#233;rez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+and+spermiation+in+the+male+European+eel:+assessment+of+sperm+quality+throughout+treatment.">Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment.</a> J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+effects+of+thermal+regime+and+alternative+hormonal+treatments+on+the+reproductive+performance+of+European+eel+males+(Anguilla+anguilla)+during+induced+sexual+maturation.">Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation.</a> Aquaculture. 354, 7-16 (2012).</li><li>Asturiano, J. F., S&#248;rensen, S. R., P&#233;rez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Production+of+Larvae+Using+Cryopreserved+Sperm:+Effects+of+Preservation+Temperature+and+Cryopreservation+on+European+Eel+Sperm+Fertilization+Capacity.">First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity.</a> Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).</li><li>Di Biase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-treatment+with+androgens+during+artificial+induction+of+maturation+in+female+eel,+Anguilla+anguilla:+Effects+on+egg+production+and+early+development.">Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development.</a> Aquaculture. 479, 508-515 (2017).</li><li>Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+in+female+silver+eels,+Anguilla+australis:+The+benefits+of+androgen+pre-treatment.">Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment.</a> Aquaculture. 437, 111-119 (2015).</li><li>Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+manipulations+for+the+enhancement+of+sperm+production+in+cultured+fish+and+evaluation+of+sperm+quality.">Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality.</a> Aquaculture. , (2016).</li><li>Ohta, H., Izawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diluent+for+cool+storage+of+the+Japanese+eel+(Anguilla+japonica)+spermatozoa.">Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa.</a> Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Eel+Sperm+Diluent+for+Short-term+Storage.">European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage.</a> Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).</li><li>Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+by+the+environmental+concentration+of+ions+of+the+potential+for+motility+in+Japanese+eel+spermatozoa.">Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa.</a> Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm.">Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physio-chemical+characteristics+of+seminal+plasma+and+development+of+media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+sperm.">Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).</li><li>Szab&#243;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm+using+different+extenders+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants.</a> Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sperm+of+farmed+European+eel+Anguilla+anguilla.">Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla.</a> J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., P&#233;rez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+European+eel+sperm+cryopreservation+method+by+preventing+spermatozoa+movement+activation+caused+by+cryoprotectants.">Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants.</a> Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).</li><li>Marco-Jim&#233;nez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+spermatozoa:+effect+of+dilution+ratio,+foetal+bovine+serum+supplementation,+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants.</a> Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sperm+cryopreservation+on+the+European+eel+sperm+viability+and+spermatozoa+morphology.">Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology.</a> Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).</li><li>Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Sexual+Maturation+in+Wild+Female+European+Eels+(Anguilla+anguilla)+in+Darkness+and+Light.">Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light.</a> Isr. J. Aquac. 64, (2012).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+and+fertilization+in+the+Japanese+eel,+Anguilla+japonica.">Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica.</a> Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cryopreservation+of+sperm+of+Japanese+eel.">Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel.</a> J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+pattern+of+eel+spermatozoa+is+affected+by+post-activation+time,+hormonal+treatment+and+the+thermal+regimen.">Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen.</a> Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).</li><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-assisted+sperm+analysis+(CASA)+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish.">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).</li><li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+sperm+motility+and+factors+affecting+sperm+quality+in+cultured+fish.">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).</li><li>Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice.">Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).</li><li>Magnotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+vitrification+of+fish+semen:+a+review+with+special+emphasis+on+marine+species.">Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species.</a> Rev. Aquacult. , (2016).</li><li>Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domaga&#322;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-thawed+motility+and+fertility+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar+L.)+sperm+frozen+with+four+cryodiluents+in+straws+or+pellets.">Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets.</a> Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).</li><li>Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitable+methods+for+cryopreservation+of+semen+from+Atlantic+halibut,+Hippoglossus+hippoglossus+L.">Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L.</a> Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+eel+(Anguilla+japonica+Temminck+&amp;+Schlegel,+1846)+propagation+using+cryopreserved+sperm+samples.">Japanese eel (Anguilla japonica Temminck &amp; Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples.</a> J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

ويصف هذا البروتوكول عملية كاملة لنعد ثعبان نضوج والمناولة والحيوانات المنوية. تربية الشروط الموضحة هنا الأمثل للنضج السريع وإنتاج كميات كبيرة من الحيوانات المنوية عالية الجودة في هذه الأنواع 6،7،25. نجاح هذا البروتوكول للواسمات وعن الاس?...

على مدى السنوات ال 25 الماضية، وقد انخفض عدد ثعبان (أنغيلا أنغيلا) التوصل إلى الساحل الأوروبي اطراد 90% 1،،من23. وهناك العديد من العوامل التي تفسر هذا الانخفاض الحاد بما في ذلك التلوث، والالتهابات، وتدمير الإفراط في صيد الأسماك، والموئل. وكل هذا كان لها تأثير عميق على هذه الأنواع، مما أدى إلى إدراج ثعبان البحر الأوروبي في "الاتحاد الدولي" لصون الطبيعة (IUCN) قائمة ك 4الحرجة المهددة بالانقراض. ونتيجة لذلك، لا بد من تطوير تقنيات وبروتوكولات للتكاثر في الأسر.
نضوج ثعبان البحر الأوروبي في الأسر ويتحقق من خلال العلاج الهرموني 5،،من67 ولكن من الصعب إنتاج الأمشاج في كلا الجنسين لمزامنة 8. 10، توقيت النضج النهائي في الإناث على الرغم من أن تنمية جديدة الاندروجين يزرع أظهرت للتعجيل بتكون البويضات في الثعابين 9،لا يزال المتغير للغاية ويصعب التحكم في 11. ولذلك، التخزين القصير الأجل للحيوانات المنوية 12،،من1314 ونعد تقنيات ضرورية لإدارة التكاثر، مما يجعل مشيج المزامنة لا لزوم لها 8.
وقد وضعت تجميد الحيوانات المنوية ثعبان منذ عام 2003 15،16. تصميم الباحثين عدة بروتوكولات ناجحة باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أو الميثانول المنتجة 16،،من1718،،من1920. على الرغم من أن كلا البروتوكولين قد استخدمت بنجاح، استمرارية الخلية التي تم الحصول عليها من الحيوانات المنوية المذابة cryopreserved مع [دمس] أقل مع الميثانول 20،21. وعلاوة على ذلك، ثعبان البحر الحيوانات المنوية يتم تفعيلها على اتصال مع [دمس] ويتطلب معالجة الحيوانات المنوية أكثر مملة 19، وبالتالي الميثانول كريوبروتيكتانت أكثر ملاءمة للحيوانات المنوية ثعبان من [دمس].
هنا، والبروتوكول للتعامل مع المثلى والعلاج الهرموني من ثعبان البحر الأوروبي سيرد أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، سوف يكون البروتوكول تجميد الحيوانات المنوية ثعبان أفضل استخدام الميثانول كريوبروتيكتانت وبروتوكول لتقييم نوعية الحيوانات المنوية في هذه الأنواع أيضا وصف.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:151px;">AQUACEN BENZOCA&#205;NA +D2A2:D24</td>
			<td style="width:128px;">AQUACEN</td>
			<td style="width:119px;">3394ESP</td>
			<td style="width:141px;">Benzocaine</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>3624-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>305501</td>
			<td>Syringe 1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FC500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Air pump 100</td>
			<td>EHEIM</td>
			<td>4011708370032</td>
			<td>Modified for suction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Eppendorf 1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>175508</td>
			<td>Plastic tubes 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>175747</td>
			<td>Plastic tubes 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flexible bucket</td>
			<td>Fiel</td>
			<td>1040101</td>
			<td>40 L, Black color.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ethanol</td>
			<td>Guinama SL</td>
			<td>Mg96270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyopreservation straws&#160;</td>
			<td>IMV Technologies</td>
			<td>14550</td>
			<td>500 &#181;L straws</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Live/Dead Sperm Viability Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7011</td>
			<td>Cytometer Kit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Modelling clay</td>
			<td>JOVI</td>
			<td>Art 30</td>
			<td>4 different colors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Precision scale PCB</td>
			<td>KERN &#38; Sohn GmbH</td>
			<td>PCB35002</td>
			<td>Digital scale</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saline solution Vitulia 0.9%</td>
			<td>Laboratorios Ern, S.A.</td>
			<td>C.N. 999790.8</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Forceps</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3710025</td>
			<td>30 cm metal forceps</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Scissors</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3700014</td>
			<td>Scissors 14cm</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ovitrelle (r-hCG)</td>
			<td>Merck SL</td>
			<td>EMEA/H/C/000320</td>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>2112211210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2SO4</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>3257091611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaHCO3</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>1416381210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">782M Camera</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>782M</td>
			<td>Camera for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ISAS v1</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>ISAS v1</td>
			<td>CASA software</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SpermTrack-10</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>SpermTrack-10</td>
			<td>Countig chamber for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Beaker Pyrex 3L</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>2110668</td>
			<td>Glass beaker 3L</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flask Pyrex 250 GL-45</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>21801365</td>
			<td>Glass flask 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>PO02000500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Methanol</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>ME03061000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>MA00370500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05482</td>
			<td>Bovine serum albumina</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Styrofoam box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34x34x30 cm and 5cm thick</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and treatment of male european eels (anguilla anguilla) for hormonal maturation and sperm cryopreservation

خلال السنوات الماضية، قد عملت مجموعات بحثية عديدة في تطوير وتحسين بروتوكولات جديدة للتعامل مع ثعبان والنضج. اعتبارا من بعد، أثبتت حقن أسبوعية تروج المشيمية البشرية (hCG) ماتوراتي الذكور بعد 5-6 أسابيع فقط من العلاج، وتنتج كميات كبيرة من الحيوانات المنوية عالية الجودة خلال عدة أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام extenders مختلفة البروتوكولات تجميد الحيوانات المنوية، المنتجة والتبريد وذوبان مرات سابقا وصفت لثعبان. هنا، نحن إظهار أن الحل الموسع Tanaka´s يمكن استخدامها مباشرة للتسميد أو لنعد، مما يجعل غير الضرورية استخدام أنواع مختلفة من الحلول وتخفيف. وعلاوة على ذلك، يجعل استخدام الميثانول كريوبروتيكتانت هذا البروتوكول سهلة الاستخدام كما الميثانول سمية منخفضة وعدم تنشيط الحيوانات المنوية. الحيوانات المنوية لا تحتاج إلى أن cryopreserved فورا بعد إضافة كريوبروتيكتانت، ويمكن استخدامه بعد فترة طويلة يجري مذاب. وعلاوة على ذلك، أن عدد الحيوانات المنوية الحركة لا تزال مرتفعة بعد ذوبان الجليد على الرغم من أنها أقل من الحيوانات المنوية الطازجة. والهدف من هذا العمل لإظهار أفضل البروتوكول متاح لثعبان المناولة والنضج، وتجميد الحيوانات المنوية.

الحيوانات المنوية من الثعابين 18 مع عدد الحيوانات المنوية حركة 70 في المائة أو أعلى من ذلك، اختير لهذه الدراسة. أظهرت النتائج انخفاضا في جميع بارامترات نوعية بعد ذوبان الجليد مقارنة مع تلك من الحيوانات المنوية الطازجة (الجدول 1 و الشكل 2). نتائج الح?...

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation at JoVE.com

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

بروتوكولات لتجميد الحيوانات المنوية ونضوج ثعبان قد تحسنت خلال السنوات الأخيرة. توضح هذه المقالة بروتوكول أفضل متوفرة باستخدام تروج المشيمية البشرية (hCG) لتحريض نضوج والميثانول كريوبروتيكتانت.

المناولة والمعالجة من الذكور ثعبان (أنغيلا أنغيلا) للنضج الهرموني وتجميد الحيوانات المنوية

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

handling-treatment-male-european-eels-anguilla-anguilla-for-hormonal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

7.8K Views.  Universitat Politècnica de València. Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

Video: Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

العزلة والحفظ بالتبريد من الأطفال حديثي الولادة الجرذ العضلية

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

تعديل التزجيج MicroSecure: وفعالة للغاية إجراء الحفظ بالتبريد آمنة وبسيطة والكيسات الأريمية الإنسان

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

نضوج الجذعية البشرية العضلية المشتقة من الخلايا في Biowires باستخدام التنبيه الكهربائي

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

فلوريميتريك تقنيات لتقييم أغشية الحيوانات المنوية

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

قياس الإرشاد المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي المخنث

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

تحديد برنامج ترجمة مرنا الأم أثناء النضوج في المختبر باستخدام اختبار مراسل Oocyte واحد

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

الجمع بين التصوير ونظام توصيل المنشطات لدراسة المنوية للفأر الحي

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

تسليط الضوء على المؤلف: تقنية تصوير الخلايا الحية لدراسة إشارات الكالسيوم وكثرة الخلايا القمية في المنوية للفأر 

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

التصوير في الوقت الحقيقي لديناميات الكالسيوم الأكروسومي والإخراج الخلوي في المنوية للفأر الحي

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...