פרסום זה מומן על ידי אופק 2020 המחקר האיחוד האירופי, חדשנות תוכנית בהסכם גרנט מארי Sklodowska-קירי לא 642893 (מראה מרהיב), המשרד העלות (עלות הפעולה פא 1205, AQUAGAMETE), ואת מרכז המחקר של המצוינות- 1476-4/2016/FEKUT.

כל ההליכים לעבודה עם צלופח האירופית שמתואר פרוטוקול זה אושרו על-ידי ועדה של אתיקה של חיה הניסויים-València דה Politècnica Universitat, בעקבות הספרדי החוקים והתקנות שליטה הניסויים ו ההליכים בבעלי חיים.
1. דג תחזוקה
<ol><li>להביא את צלופחים האירופית מתקן מחקר ולשים אותם aquaria 200 L עם מערכת recirculation. השתמש טרמוסטטים וגופי כדי לשמור על טמפרטורה קבועה-20 ° C.</li>
	<li>לשמור על הדגים בתנאים כהה כדי למנוע מתח22 , בלי אוכל במהלך הניסוי.</li>
	<li>לשמור את הדגים במים מתוקים במהלך 3 הימים הראשונים. ואז לשנות את 1/3 מכמות המים, ממלאים עם מי ים בכל יום עד שהגיע עם מליחות של 37.0 ± 0.3 g/ל'</li>
</ol>2. טיפול הורמונלי
הערה: טיפול הורמונלי מורכב זריקות שבועיות של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) לאורך כל משך (9 שבועות) הניסוי.
<ol><li>הכן את ההורמון hCG מראש-ריכוז של IU 1/µL על ידי דילול ההורמון בתמיסת (0.9% NaCl). הערה: ההורמון יכול להישמר מדולל בריכוז זה במשך יותר משבוע ב-18 ° c</li>
	<li>כדי עזים ומתנגד הדגים, להכין 40 אני גמיש דלי עם 5 L של מערכת המים.<ol>
<li>בבקבוקון 250 מ ל, לדלל 300 מ"ג בנזוקאין ב- 100 מ של 70% אתנול.</li>
		<li>יוצקים את בנזוקאין מדולל בדלי (הריכוז הסופי 0.36 מ מ) ומערבבים היטב. . זה ריכוז בנזוקאין הסופי של 60 מ ג/ל'</li>
		<li>להעביר את הדגים, בנפרד, לתוך המים עם בנזוקאין, המתן מספר שניות עד בנזוקאין נכנס לתוקף, הדג הוא מורדם כראוי. הערה: כדי לאשר הדגים. הוא מורדם, מניחים את הדגים במצב פרקדן, בדוק כי זה נשאר עדיין במצב הזה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לנהל את ההורמון, שוקל את הדגים ולהכין ההורמון hCG במינון של 1.5 IU/g של דגים, צינור פלסטיק 1.5 מ.<ol>
<li>ממלאים מזרק 1 מ"ל ההורמון hCG מהצינור פלסטיק.</li>
		<li>מניחים את הדגים anesthetized במצב פרקדן, עם הסיוע או את המזרק, להזריק הורמון בקפידה באזור בקרום הבטן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להחזיר את הדגים באקווריום, לפקח עליו עד החלים לחלוטין. הערה: המינהל הורמונלי צריך להתנהל שבועית לאורך כל הניסוי. בדרך כלל, צלופחים האירופית להתחיל spermating לאחר 6-7 שבועות של טיפול הורמונלי.</li>
</ol>3. זרע הדגימה
<ol><li>כדי להשיג את הדוגמאות הטובות ביותר של איכות, תמצית זרע 24 שעות לאחר ניהול הורמונלי6,23.</li>
	<li>עזים ומתנגד הדג עם בנזוקאין כפי שמתואר בשלב 2.2.</li>
	<li>מניחים את הדגים anesthetized במצב פרקדן, אזור איברי המין עם טיפת מים מזוקקים יבש ונקי בקפידה בנייר, כדי להימנע צואה זיהום נוכח באזור איברי המין או הפעלת זרע בשוגג על ידי מגע עם מי ים באקווריום.</li>
	<li>הנחת האצבעות על משני צדי הדג, עיסוי בקפידה הקשת רוחבית מ במינימום באזור איברי המין כדי לאלץ את הזרע החוצה.<ol>
<li>חזור על העיסוי עד אין תאי זרע נוסף יוצא מן הפתח באברי המין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף את הזרע לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל באמצעות משאבה ואקום.</li>
	<li>לדלל את הזרע שחולצו 1:10 ששונה Tanaka´s extender פתרון24 (137 מ"מ NaCl, 76.2 מ מ NaHCO3, בתוך מים מזוקקים) ב- 4 ºC. הערה: הזרע בפתרון ה-extender אמור להישמר 4 ºC.</li>
</ol>4. הערכת איכות הזרע
<ol><li>להכין מי ים מלאכותי13 (במ מ: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9.9, נה2אז4 28.2, אשלגן כלורי 9.4, במים מזוקקים) עם 2% שור אלבומין (BSA) (w:v), להתאים את ה-pH ל 8.2, osmolality עד 1100 mOsm/kg ולתחזק זה 4 ºC כדי למנוע התפתחות חיידקים.</li>
	<li>פתח את תוכנת המחשב בסיוע זרע בניתוח (CASA) ובחר את המודול זרע של דג.<ol>
<li>לחץ על מאפיינים כדי לפתוח את הגדרת המערכת של התוכנה. שם, הגדר את האפשרויות לכידת-60 תמונות בשניה. אופטיקה בחר שלב שלילית, Makler קאמרית, סולם X 10.</li>
		<li>ואז על ניתוח הערכים, בחר דגים מינים, חלקיקים אזור גדול יותר מיקרומטר 22 וקטנות יותר מיקרומטר 202.</li>
		<li>על הפרמטרים מהירות, הגדר איטי כאשר תאים לעבור בין 10 ל- 45 מיקרומטר/s, מוגדר בינוני כאשר נע בין 45 ל 100 מיקרומטר/s מוגדר מהירה כאשר זז מהר יותר 100 מיקרומטר/s. הערה: Spermatozoa עם מהירות איטית יותר מ- 10 מיקרומטר/s נחשבו immotile.</li>
		<li>בחר את ערכי מתקדמת כמו 80% של יושר (STR) ולשמור את המאפיינים.</li>
		<li>לחץ על השדה ללכוד (חלון עם תמונות בשידור חי מן המצלמה תיפתח). הערה: מערכת ניתוח המחשב בסיוע זרע נוצר על ידי מיקרוסקופ, מצלמה, תוכנת ניתוח של התמונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>על החדר ספירה, לשים 4 µL של מי ים מלאכותי, להוסיף 0.5 µL של זרע פתרון (זרע מדולל בפתרון ה-extender).<ol>
<li>למקד את התמונה עם המיקרוסקופ בהגדלה X 10 בשלב שלילי. 15 s לאחר ההפעלה, לחץ על לכידת - וידאו בתוכנת ניתוח המחשב בסיוע זרע.</li>
		<li>לנתח כל מדגם triplicate ובחרו הדגימות עם תנועתיות גבוה יותר מאשר 70 אחוז על הקפאה קריוגנית. הערה: חשוב מאוד לבחור רק באיכות גבוהה זרע להצלחת פרוטוקול זה הקפאה קריוגנית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. זרע שיטת הקפאה
<ol><li>להכין מראש חנ (כ- 2.5 L) ב 34 ס"מ x 34 ס"מ x 30 ס מ ו תיבת קלקר בעובי 5 ס מ. הערה: לשמור על רמה של חנקן נוזלי של 4-5 ס מ גובה כל הזמן.<ol>
<li>לבנות מבנה צפה מראש להקפיא את הזרע. 2 חתיכות פוליסטירן (20 ס מ x 5 ס מ), לאגד אותם עם 2 צינורות פלסטיק ושימוש במקום המבנה על-החנקן הנוזלי. מבנה זה צריך לרחף מעל החנקן הנוזלי בגובה משוער של 3 ס מ מעל פני השטח (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56835/56835fig1.jpg"> איור 1 . הסכימטי של המבנה צף המשמש עבור הקפאת מראש על חנקן נוזלי. המבנה מורכב שתי חתיכות של צפיפות נמוכה קלקר של 20 ס"מ על 4 ס"מ x 5 ס מ מחובר עם צינורות פלסטיק של 14 ס מ. הקשיות ממוקמים מעל צינורות פלסטיק של 3 ס מ מעל החנקן הנוזלי. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56835/56835fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"><li>הכן את הפתרון הקפאה קריוגנית על ידי ערבוב זרע, פתרון ה-extender, מתנול ביחס של 1:8:1 1.5 mL פלסטיק צינורות ומערבבים בעדינות.</li>
	<li>בעזרת פיפטה, להוסיף µL 480 של הפתרון הקפאה קריוגנית לתוך קשיות µL 500, במידת הצורך, לסמן אותם על-ידי סגירת קצה אחד עם דגמי חמר.</li>
	<li>לשים את הקש על המכשיר צף בגובה של 3 ס מ מעל החנקן הנוזלי למשך 3 דקות. אז, במקום את הקש לתוך החנקן הנוזלי.</li>
	<li>לאחר 10-15 דקות, להעביר את הקשיות לתוך מיכל אחסון בחנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ארוכות ולשמור אותם שקועים חנקן נוזלי בכל עת. . הנה, הזרע ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן.</li>
</ol>6. שיטת מפשיר
<ol><li>הכנת קופסת קלקר עם חנקן נוזלי, כפי שמתואר בשלב 5.1 והכן באמבט מים באמצעות 3 L גביע עם מי ברז ב 40 ºC.</li>
	<li>להעביר את הקשיות בזרע קפוא מ למיכל אחסון לתוך התיבה קלקר עם חנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ארוכות.<ol>
<li>לשים כל קש לתוך אמבט מים ב 40 ºC עבור 13 s.</li>
		<li>שופכים את הזרע לתוך צינור פלסטיק 1.5 mL על ידי גזירה את קצוות סגורים של הקש עם מספריים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את תנועתיות הזרע באמצעות המחשב בסיוע זרע ניתוח המערכת כמוסבר בשלב 4.1.</li>
	<li>שמור µL 100 של זרע כדי לנתח את הכדאיות של spermatozoa עם cytometer זרימה.</li>
</ol>7. דנ
<ol><li>להשתמש ערכת פלורסנט המכיל propidium יודיד (PI), אשר הוא מתחם ניאון אדום זה מכתים את הגרעינים של תאים מתים, ממברנה-permeant מתחם פלורסנט גרעינית, ירוק מכתים את הגרעינים של תאים חיים.<ol>
<li>הכן את הפתרון מכתימים ניאון ירוק על ידי לדלל אותה מן המניות פתרון (1 מ מ) 1:10 Tanaka´s בינוני לפתרון עבודה של 100 מיקרומטר.</li>
		<li>לא לדלל את הפתרון PI. הפתרון מניות הוא 2.4 מ"מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור כל דגימה, לקחת 50 µL של זרע טרי או המופשרים ולהוסיף 0.5 µL של פלורסנט ירוק מכתים הפתרון עובד (ריכוז סופי 1 מיקרומטר) ו- 2 µL של פתרון PI (ריכוז סופי 100 מיקרומטר).</li>
	<li>דגירה בדגימות המכיל הצבעים (PI, צביעת ניאון ירוק) בחושך במשך 5 דקות.<ol>
<li>לדלל את הדגימות ב 500 µL של פתרון ה-extender Tanaka´s ולנתח עם cytometer הזרימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפעיל את cytometer זרימה וליצור פרוטוקול חדש המכיל לפחות 2 מגרשים: SS רישום יומן vs FS, FL1 לעומת FL3. הערה: שני, פלורסנט יודיד מכתים, propidium יכול להיות שמחים עם אור גלוי באורך הגל הירוק. מתי קשור ל- DNA, פליטת קרינה פלואורסצנטית מרבי צבעים אלה הם 516 nm ו 617 nm, בהתאמה.<ol>
<li>התאם את המתחים של לייזרים שונים: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372</li>
		<li>להגדיר את הסכם רכישה הגדרות לאירועים מרבי = s 5000 או 15 (הריכוז הסופי של המדגם צריך להיות כ- 1 מיליון של תאים/mL). קרא את הדגימה באמצעות זרם נמוך .</li>
		<li>בחר את מצב הקריאה צינור יחיד קבוע בעמדה מצב.</li>
		<li>הכניסו את הדגימה המספר הנכון של הקרוסלה</li>
		<li>לקרוא את הדגימה (הקשת F9) ולשמור את הנתונים שנאספו לקובץ excel (לחיצה על F7) לצורך ניתוח נוסף.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>ICES_Working_Group_on_Eels. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).</li><li>Moriarty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Catches+of+Elver+of+1928-1988.">European Catches of Elver of 1928-1988.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).</li><li>Dekker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+geometry+of+the+European+eel+stock.">The fractal geometry of the European eel stock.</a> ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).</li><li>Jacoby, D., Gollock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hCG+as+spermiation+inducer+on+European+eel+semen+quality.">Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality.</a> Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).</li><li>P&#233;rez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+and+spermiation+in+the+male+European+eel:+assessment+of+sperm+quality+throughout+treatment.">Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment.</a> J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+effects+of+thermal+regime+and+alternative+hormonal+treatments+on+the+reproductive+performance+of+European+eel+males+(Anguilla+anguilla)+during+induced+sexual+maturation.">Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation.</a> Aquaculture. 354, 7-16 (2012).</li><li>Asturiano, J. F., S&#248;rensen, S. R., P&#233;rez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Production+of+Larvae+Using+Cryopreserved+Sperm:+Effects+of+Preservation+Temperature+and+Cryopreservation+on+European+Eel+Sperm+Fertilization+Capacity.">First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity.</a> Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).</li><li>Di Biase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-treatment+with+androgens+during+artificial+induction+of+maturation+in+female+eel,+Anguilla+anguilla:+Effects+on+egg+production+and+early+development.">Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development.</a> Aquaculture. 479, 508-515 (2017).</li><li>Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+in+female+silver+eels,+Anguilla+australis:+The+benefits+of+androgen+pre-treatment.">Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment.</a> Aquaculture. 437, 111-119 (2015).</li><li>Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+manipulations+for+the+enhancement+of+sperm+production+in+cultured+fish+and+evaluation+of+sperm+quality.">Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality.</a> Aquaculture. , (2016).</li><li>Ohta, H., Izawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diluent+for+cool+storage+of+the+Japanese+eel+(Anguilla+japonica)+spermatozoa.">Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa.</a> Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Eel+Sperm+Diluent+for+Short-term+Storage.">European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage.</a> Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).</li><li>Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+by+the+environmental+concentration+of+ions+of+the+potential+for+motility+in+Japanese+eel+spermatozoa.">Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa.</a> Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm.">Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physio-chemical+characteristics+of+seminal+plasma+and+development+of+media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+sperm.">Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).</li><li>Szab&#243;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm+using+different+extenders+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants.</a> Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sperm+of+farmed+European+eel+Anguilla+anguilla.">Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla.</a> J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., P&#233;rez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+European+eel+sperm+cryopreservation+method+by+preventing+spermatozoa+movement+activation+caused+by+cryoprotectants.">Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants.</a> Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).</li><li>Marco-Jim&#233;nez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+spermatozoa:+effect+of+dilution+ratio,+foetal+bovine+serum+supplementation,+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants.</a> Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sperm+cryopreservation+on+the+European+eel+sperm+viability+and+spermatozoa+morphology.">Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology.</a> Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).</li><li>Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Sexual+Maturation+in+Wild+Female+European+Eels+(Anguilla+anguilla)+in+Darkness+and+Light.">Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light.</a> Isr. J. Aquac. 64, (2012).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+and+fertilization+in+the+Japanese+eel,+Anguilla+japonica.">Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica.</a> Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cryopreservation+of+sperm+of+Japanese+eel.">Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel.</a> J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+pattern+of+eel+spermatozoa+is+affected+by+post-activation+time,+hormonal+treatment+and+the+thermal+regimen.">Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen.</a> Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).</li><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-assisted+sperm+analysis+(CASA)+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish.">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).</li><li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+sperm+motility+and+factors+affecting+sperm+quality+in+cultured+fish.">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).</li><li>Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice.">Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).</li><li>Magnotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+vitrification+of+fish+semen:+a+review+with+special+emphasis+on+marine+species.">Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species.</a> Rev. Aquacult. , (2016).</li><li>Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domaga&#322;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-thawed+motility+and+fertility+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar+L.)+sperm+frozen+with+four+cryodiluents+in+straws+or+pellets.">Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets.</a> Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).</li><li>Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitable+methods+for+cryopreservation+of+semen+from+Atlantic+halibut,+Hippoglossus+hippoglossus+L.">Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L.</a> Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+eel+(Anguilla+japonica+Temminck+&amp;+Schlegel,+1846)+propagation+using+cryopreserved+sperm+samples.">Japanese eel (Anguilla japonica Temminck &amp; Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples.</a> J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר את התהליך המלא של הקפאה קריוגנית, התבגרות, טיפול, זרע, צלופח האירופית. גידול בתנאים המתוארים כאן הם אופטימלית עבור התבגרות מהירה והפקה של אמצעי אחסון גבוהה באיכות גבוהה הזרע הזה מינים 6,7,25. ההצלחה של פרוטוקול זה הקפאה קריו?...

במהלך 25 השנים האחרונות, המספר של צלופחים האירופית (אנגווילה אנגווילה) המגיעים בחוף באירופה ירדו בהתמדה על ידי 90% 1,2,3. ישנם מספר גורמים המסבירים זו ירידה דרסטית כולל זיהום, זיהומים, דייג והרס בית גידול. כל זה יש לו השפעה עמוקה על מין זה, המוביל אל ההכללה של הצלופח האירופית על האיחוד הבינלאומי לשימור הטבע (IUCN) רשימת כמו בסכנת הכחדה קריטית 4. כתוצאה מכך, התפתחות טכניקות ופרוטוקולים עבור רבייה בשבי נחוצים.
ההבשלה של הצלופח האירופית בשבי מושגת על ידי טיפול הורמונלי 5,6,7 אבל בייצור גמטות משני המינים קשה לסנכרן את 8. למרות ההתפתחות של השתלים אנדרוגן חדשים הראו להאיץ oogenesis צלופחים 9,10, העיתוי של ההבשלה הסופי אצל נקבות הוא עדיין מאוד משתנה וקשה לשלוט 11. לכן, אחסון לטווח קצר של הזרע 12,13,14 והקפאה קריוגנית טכניקות נחוצים עבור ניהול רבייה, גורם תא רבייה סינכרון מיותרים 8.
הקפאה קריוגנית בזרע צלופח האירופית פותחה מאז 2003 15,16. מספר חוקרים תוכנן פרוטוקולים מוצלח באמצעות דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או מתנול cryoprotectants 16,17,18,19,20. למרות פרוטוקולים שימשו בהצלחה, הכדאיות שהושג תא הזרע המופשרים cryopreserved עם דימתיל סולפוקסיד הוא נמוך יותר מאשר עם מתנול 20,21. יתר על כן, צלופח זרע מופעל במגע עם דימתיל סולפוקסיד ודורש יותר מייגע זרע מניפולציה 19, לכן מתנול cryoprotectant מתאים יותר לזרע צלופח האירופי מאשר דימתיל סולפוקסיד.
. הנה, פרוטוקול טיפול אופטימלי וטיפול הורמונלי הצלופח האירופית שיפורט להלן. בנוסף לכך, הפרוטוקול הטוב ביותר של הקפאה קריוגנית זרע צלופח האירופי שימוש מתנול cryoprotectant ופרוטוקול להערכת איכות זרע במין הזה יהיה גם המתואר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:151px;">AQUACEN BENZOCA&#205;NA +D2A2:D24</td>
			<td style="width:128px;">AQUACEN</td>
			<td style="width:119px;">3394ESP</td>
			<td style="width:141px;">Benzocaine</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>3624-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>305501</td>
			<td>Syringe 1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FC500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Air pump 100</td>
			<td>EHEIM</td>
			<td>4011708370032</td>
			<td>Modified for suction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Eppendorf 1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>175508</td>
			<td>Plastic tubes 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>175747</td>
			<td>Plastic tubes 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flexible bucket</td>
			<td>Fiel</td>
			<td>1040101</td>
			<td>40 L, Black color.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ethanol</td>
			<td>Guinama SL</td>
			<td>Mg96270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyopreservation straws&#160;</td>
			<td>IMV Technologies</td>
			<td>14550</td>
			<td>500 &#181;L straws</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Live/Dead Sperm Viability Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7011</td>
			<td>Cytometer Kit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Modelling clay</td>
			<td>JOVI</td>
			<td>Art 30</td>
			<td>4 different colors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Precision scale PCB</td>
			<td>KERN &#38; Sohn GmbH</td>
			<td>PCB35002</td>
			<td>Digital scale</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Saline solution Vitulia 0.9%</td>
			<td>Laboratorios Ern, S.A.</td>
			<td>C.N. 999790.8</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Forceps</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3710025</td>
			<td>30 cm metal forceps</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Scissors</td>
			<td>Levantina de Lab. SL</td>
			<td>3700014</td>
			<td>Scissors 14cm</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ovitrelle (r-hCG)</td>
			<td>Merck SL</td>
			<td>EMEA/H/C/000320</td>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nikon Eclipse 80i</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CaCl2</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>2112211210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Na2SO4</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>3257091611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaHCO3</td>
			<td>Panreac Quimica SAU</td>
			<td>1416381210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">782M Camera</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>782M</td>
			<td>Camera for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ISAS v1</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>ISAS v1</td>
			<td>CASA software</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SpermTrack-10</td>
			<td>Proiser</td>
			<td>SpermTrack-10</td>
			<td>Countig chamber for CASA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Beaker Pyrex 3L</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>2110668</td>
			<td>Glass beaker 3L</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flask Pyrex 250 GL-45</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>21801365</td>
			<td>Glass flask 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KCl</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>PO02000500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Methanol</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>ME03061000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Scharlab SL</td>
			<td>MA00370500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05482</td>
			<td>Bovine serum albumina</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Styrofoam box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>34x34x30 cm and 5cm thick</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling and treatment of male european eels (anguilla anguilla) for hormonal maturation and sperm cryopreservation

במהלך השנים האחרונות, מספר קבוצות מחקר עובדים על פיתוח, שיפור של פרוטוקולים חדשים עבור טיפול צלופח האירופית ו ההבשלה. כמו של עוד, זריקות שבועיות של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) הוכח כי maturate זכרים אחרי רק 5-6 שבועות של טיפול, בהפקת כרכים גבוהה של זרע באיכות גבוהה במהלך מספר שבועות. בנוסף, פרוטוקולים הקפאה קריוגנית הזרע באמצעות מרחיקי שונים, cryoprotectants, קירור, מפשיר פעמים בעבר תוארו עבור צלופח האירופית. כאן, נראה כי הפתרון extender Tanaka´s ניתן להשתמש ישירות עבור הפריה או הקפאה קריוגנית, עושה את השימוש של סוגים שונים של פתרונות דילולים מיותרים. יתר על כן, השימוש של מתנול cryoprotectant הופך את פרוטוקול זה קל לשימוש כפי מתנול יש רעילות נמוכה והוא אינו מפעיל את הזרע. הזרע אינו צריך להיות cryopreserved מיד לאחר התוספת של cryoprotectant, זה יכול לשמש זמן רב לאחר להיות הקרת. יתר על כן, תנועתיות הזרע הוא עדיין גבוה לאחר מפשיר למרות שזה נמוך יותר מזה של זרע טרי. מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול זמינים בצורה הטובה ביותר עבור אירופה צלופח טיפול, התבגרות, הקפאה קריוגנית זרע.

הזרע של צלופחים 18 עם תנועתיות הזרע 70% ומעלה, נבחר במחקר זה. התוצאות הראו ירידה בפרמטרי איכות כל לאחר מפשיר בהשוואה לאלו של זרע טרי (טבלה 1 ואיור 2). התוצאות תנועתיות (זאת אומרת ± S.E.M., n = 18) הראו על תנועתיות מוחלט גבוה יותר, תנועתיות מתקדמת של זרע טרי יו...

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation at JoVE.com

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

פרוטוקולים עבור הקפאה קריוגנית, התבגרות, זרע, צלופח האירופית שופרו בשנים האחרונות. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול הטוב ביותר הזמינים באמצעות גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עבור גרימת ההבשלה, מתנול כמו cryoprotectant.

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

handling-treatment-male-european-eels-anguilla-anguilla-for-hormonal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

7.8K Views.  Universitat Politècnica de València. Hi, my name is Juan Asturiano from the Polytechnic University of Valencia, and we are with some of our colleagues from the Szent Istv

Video: Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

בידוד וCryopreservation של שריר לב עכברוש ילודים

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Vitrification MicroSecure השתנה: כספת, פשוט מאוד נוהל Cryopreservation אפקטיבי עבור blastocysts אנוש

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

התבגרות של האדם גזע גזע נגזר Cardiomyocytes ב ביאוירס באמצעות גירוי חשמלי

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

שילוב הדמיה עם מערכת העברת ממריצים לחקר זרע עכבר חי

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

מחבר זרקור: טכניקת דימות תאים חיים לחקר איתות סידן ואקרוזום אקסוציטוזה בזרע עכבר 

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואקסוציטוזה בזרע עכבר חי

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...